Лечение коронавируса лекарство от covid ковида 19 средство от инфекции, профилактика, что делать, восстановление после ! Убивает вирус на 100%

В университете имени Сеченова весной 2020 года было открыто (не изобретено) лекарство от ковида (COVID-19), секретной информацией это не стало, но стало замалчиваться, при том что данные обстоятельства и 100% положительный лечебный результат был получен и данные опубликованы на официальном сайте медицинского университета. Лекарство лечит быстро (1-5 дней) и стоит дешево (продается в розницу в аптеке без рецепта врача по цене 80-100 руб). Кроме того открыта информация о том, что этим же средством успешно вылечили больных и в различных иных странах, таких как Канада, США, Франция, Германия, Великобритания, Китай .... Также мы собрали открытые публичные видео с сообщениями различных официальных СМИ и просто людей об этом средстве (лекарстве) от коронавируса. Прошу посмотреть все видео на данную тему и распространить с целью помочь больным и/или запуганным людям. Да, конечно речь о метиленовом синем (в простонародье синька).

 At the Sechenov University in the spring of 2020, a cure for covid (covid 19) was discovered (not invented), this did not become classified information, but it began to be hushed up, despite the fact that these circumstances and a 100% positive therapeutic result were obtained and the data were published on the official website medical university. The medicine heals quickly (1-5 days) and is cheap (retail at a pharmacy without a doctor's prescription at a price of 80-100 rubles). In addition, information is open that the same remedy has successfully cured patients in various other countries, such as Canada, USA, France, Germany, Great Britain, China ... We also collected open public videos with reports from various official media and just people about this remedy (medicine) for the coronavirus. Please watch all videos on this topic and distribute them in order to help sick and / or intimidated people. Yes, of course we are talking about methylene blue (in common people blue)

An der Sechenov-Universität wurde im Frühjahr 2020 ein Heilmittel für Covid (Covid 19) entdeckt (nicht erfunden), dies wurde nicht als Verschlusssache, sondern wurde vertuscht, obwohl diese Umstände und eine 100%ige positive therapeutische Ergebnisse wurden erzielt und die Daten wurden auf der offiziellen Website der medizinischen Universität veröffentlicht. Das Medikament heilt schnell (1-5 Tage) und ist billig (Einzelhandel in einer Apotheke ohne ärztliches Rezept zu einem Preis von 80-100 Rubel). Darüber hinaus ist die Information offen, dass das gleiche Mittel Patienten in verschiedenen anderen Ländern wie Kanada, USA, Frankreich, Deutschland, Großbritannien, China erfolgreich geheilt hat ... Wir haben auch öffentlich zugängliche Videos mit Berichten verschiedener offizieller Medien und nur Menschen über dieses Mittel (Medikament) gegen das Coronavirus gesammelt. Bitte sehen Sie sich alle Videos zu diesem Thema an und verteilen Sie diese, um kranken und/oder eingeschüchterten Menschen zu helfen. Ja, natürlich sprechen wir von Methylenblau (im Normalfall blau).

En la Universidad Sechenov en la primavera de 2020, se descubrió (no se inventó) una cura para el covid (covid 19), esto no se convirtió en información clasificada, pero comenzó a silenciarse, a pesar de que estas circunstancias y un 100% Se obtuvieron resultado terapéutico positivo y los datos se publicaron en la web oficial de la universidad médica. El medicamento se cura rápidamente (de 1 a 5 días) y es barato (se vende al por menor en una farmacia sin receta médica a un precio de 80 a 100 rublos). Además, hay información abierta de que el mismo remedio ha curado con éxito a pacientes en varios otros países, como Canadá, Estados Unidos, Francia, Alemania, Gran Bretaña, China ... También recopilamos videos públicos abiertos con informes de varios medios oficiales y solo personas sobre este remedio (medicamento) para el coronavirus. Mire todos los videos sobre este tema y distribúyalos para ayudar a las personas enfermas y / o intimidadas. Sí, por supuesto que estamos hablando de azul de metileno (en la gente común azul).

 Лекарство от коронавируса COVID-19

Копеечное средство быстрого лечения разных ОРВИ открыто российскими учеными из университета им. Сеченова (The cure for covid 19 is a penny remedy for the rapid treatment of various acute respiratory viral infections discovered by Russian scientists from the University. Sechenov - Methylenum coeruleum C16H18ClN3S )

 Как метиленовая синька воздействует на коронавирус? Смотрите видео до конца и узнаете подробности о применении метиленового синего! При лечении многих заболеваний с поражением слизистых и кожи используются красители. Одним из таких средств является метиленовый синий или метиленовая синька. Какие особенности препарата Метиленовая синька? Это средство обладает антисептическими свойствами, противовирусной активностью, применяется как антидот при отравлении некоторыми соединениями, подавляет рост и развитие патологических клеток. Препарат нашел широкое применение в медицине, используются как водный, так и спиртовой растворы. Применяется в урологии, стоматологии, гинекологии, отоларингологии и ветеринарии. 

Публикация на официальном сайте университета имени Сеченова

Публикация на официальном сайте доктора Евдокименко

Подробно о коронавирусной инфекции

Научное открытие средства для лечения коронавируса 

Раствор красителя метиленовый синий, известный в народе как «синька», может уничтожать коронавирус в организме человека. К такому выводу пришли российские ученые из Сеченовского университета
В ходе экспериментального лечения пациенты с диагнозом COVID-19 и разной степенью поражения легких полностью выздоровели. В группе добровольцев, принимавших метиленовый синий с целью профилактики, никто не заболел. Значит ли это, что эффективное лекарство от новой болезни наконец найдено?

Долгие месяцы мы наблюдаем за тем, как ВОЗ и представители Big Farma по всему миру ищут эффективное лекарство от COVID-19. Поскольку создание нового препарата — дело не быстрое, а людей по всему миру необходимо лечить, было разрешено применять некоторые медикаменты off-label, то есть не по назначению. И нашумевший гидроксихлорохин, и фавилавир, и многие другие лекарства, которые применялись и применяются для лечения коронавирусной инфекции, создавались для совершенно других болезней. Многие из них трудно купить, а некоторые еще и довольно дорогие.

И вот на фоне непростой ситуации с лечением COVID-19 приходит новость о том, что синий краситель — старое и копеечное медицинское средство (около 8 руб. за дозу), оказывается, может эффективно лечить коронавирусную инфекцию. Вещество убивает сам вирус, восстанавливает многие функции организма и борется с последствиями болезни. Неужели это правда? Научные изыскания на текущий момент (июль 2020 года) говорят — похоже, что так. 

Знакомьтесь, метиленовый синий против ковида

У пресловутой «синьки» солидное научное реноме. Вещество было синтезировано в 1877 году и изначально применялось в медицине и промышленности как краситель и пигмент. Но позже выяснилось, что метиленовый синий (МС) обладает широким спектром терапевтических свойств в том числе и уничтожает вирус коронавируса, но не только.

С XIX века и по настоящее время МС применяется как противомалярийный препарат. Он одинаково эффективен против всех видов этого паразитарного заболевания.

• МС — одно из первых лекарств, которое успешно применяли для лечения психозов, биполярного и нейродегенеративных расстройств, в том числе деменции и болезни Альцгеймера.
• МС считается эффективным лекарством от метгемоглобинемии — состояния, при котором в крови повышается содержание метгемоглобина (окисленного гемоглобина) и развивается тканевая гипоксия.
• МС входит в список жизненно-важных препаратов по версии Всемирной организации здравоохранения как антидот при отравлении цианидами, угарным газом и сероводородом.
• МС — мощный антиоксидант, который способен блокировать окислительный каскад в организме.
• МС — противовоспалительное средство широкого спектра действия.
• МС обладает и ярким противовирусным эффектом. В 2018 году было доказано, что метиленовый синий инактивирует в плазме крови вирус Эбола и коронавирус MERS-CoV, вызывающий острый ближневосточный респираторный синдром.

Возможно усиление антивирусных свойств в десятки раз:

Раствор метиленового синего известен как фотосенсибилизатор. Это группа светочувствительных веществ, действие которых усиливается при воздействии света с соответствующей длиной волны. Фотосенсибилизатор переносит энергию света на кислород, благодаря чему он переходит в так называемое синглетное состояние. Синглетный кислород химически очень активен: он окисляет белки и другие биомолекулы, разрушая внутренние структуры патологических клеток, после чего они становятся нежизнеспособными.

Такое свойство фотосенсибилизаторов позволило успешно применять их в фотодинамической терапии при лечении онкологических заболеваний.

Метиленовый синий против SARS-CoV-2: как родилась идея? 

Идея родилась в Институте кластерной онкологии имени Л.Л. Левшина на базе Университетской клинической больницы № 1 Сеченовского университета.

В разгар эпидемии коронавируса, как и многие другие медицинские учреждения в Москве, институт был перепрофилирован под ковидный госпиталь. На тот момент уже существовал список рекомендованных лекарств и протокол лечения одобренный Минздравом России, но сеченовские онкологи все равно задумались о поиске альтернативных методов лечения.

«Поскольку мы совместно с физиками из Института общей физики РАН давно и успешно применяем фотодинамические методы для лечения онкологических больных, то сразу вспомнили об известном фотосенсибилизаторе — метиленовом синем. Он как раз находился у нас в разработке по проекту фотодинамической терапии опухолей мозга. Уже были опубликованы работы российских и зарубежных ученых, подтверждающие способность синего красителя уничтожать некоторые патогенные вирусы в плазме крови при воздействии красного света. И пока мы продумывали, как применить этот опыт к истории с COVID-19, вышла публикация китайских ученых. В статье был описан успешный опыт инактивации вируса SARS-CoV-2 в плазме крови инвитро (то есть в пробирке) с применением светового облучения при различных дозировках метиленового синего. Вирус погибал за считанные минуты при воздействии метиленового синего и за считанные секунды при дополнительном облучении красным светом. Эта работа помогла нам разработать свой протокол лечения. Первыми добровольцами, принявшими метиленовый синий были: я сам, академик РАН и директор Института кластерной онкологии Игорь Решетов, а также профессор Института общей физики РАН Виктор Лощенов. Его лаборатория разрабатывает для нас оборудование для фотодинамической терапии».

По словам хирурга-онколога Ширяева, никакого страха перед приемом метиленового синего не было — препарат давно зарекомендовал свою безопасность. К тому же ученым нужно было точно рассчитать дозу, способную убивать вирус; понять, как это вещество будет выводиться из организма; и спроектировать лазерную установку для проведения фотодинамической терапии.

«Когда мы начали эту работу, пандемия была в разгаре. Все в Москве сидели на самоизоляции. Я не мог работать в своей лаборатории, поэтому все подготовительные исследования проводил у себя дома. Я исследовал фармакокинетику метиленового синего на себе и добровольцах и параллельно осуществлял разработку облучателя. В последствии лазерные установки со световой мощностью десятикратно превышающей существующие аналоги, были созданы студентами-выпускникам Института общей физики. Они поставили у себя в общежитии 3D-принтеры, закупили комплектующие и с их помощью «напечатали» четыре облучателя».

После того как и оборудование, и протокол лечения были готовы, ученые подали заявку в независимый локальный комитет по этике Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова Минздрава России.

Исследование было утверждено 24 апреля 2020, уже на следующий день экспериментальное лечение метиленовым синим было предложено испытать на себе пациентам с коронавирусной инфекцией. Как ни странно, многие охотно согласились.

Как проходило испытание метиленового синего на больных COVID-19

Исследование проводилось с 25 апреля по 24 мая 2020. В нем приняло участие 43 пациента с подтвержденным диагнозом COVID-19 и 39 добровольцев. В последнюю группу вошли люди с высоким риском заражения — врачи, работавшие в «красной зоне», взрослые члены их семей и ученые, участвовавшие в разработке исследования.

Все добровольцы принимали препарат еженедельно, выпивая индивидуально рассчитанную дозу метиленового синего, разведенного в стакане воды. Фотодинамическая терапия в группе добровольцев не применялась.

Среди 43 пациентов были люди с разной степенью тяжести заболевания и с разной степенью поражения легких: от 25 до 75% по результатам компьютерной томографии. Все они помимо стандартного симптоматического лечения получали метиленовый синий в виде ингаляций и перорально в сочетании с фотодинамической терапией.

С помощью спроектированной светодиодной установки врачи воздействовали красным светом с длиной волны 665 нм на зону носоглотки и груди каждого пациента. При таком воздействии метиленовый синий усиливает свою активность почти в десять раз.

Об эффективности препарата от коронавируса

Эффект от лечения наступал быстро. Уже на следующий день у многих пациентов температура спадала с 39°С до 36,6°С. Полностью возвращалось утраченное обоняние. Люди отмечали общее улучшение самочувствия и восстановление функций дыхания. У многих исчезали боли в грудной клетке.

К реанимационным больным возвращалась способность дышать самостоятельно, поднимался уровень сатурации (насыщение крови кислородом). Наблюдалась положительная динамика по КТ — исчезал эффект матового стекла.

После однократного ингаляционного применения метиленового синего с сопутствующей фотодинамической терапией уже на следующий день ПЦР-тест на SARS-CoV-2 у всех пациентов был отрицательным. Вирус был полностью элиминирован из организма.

На 10 и 12 день после госпитализации повторный ПЦР-тест тоже не обнаруживал вирус ни у одного из участников исследования, включая группу добровольцев.

За все время проведения исследования ни у одного из испытуемых не было выявлено никаких побочных эффектов на препарат метиленовый синий.

Как относиться к результатам исследования лекарства от коронавируса?

Директор Института кластерной онкологии Сеченовского университета и академик РАН Игорь Решетов считает, что потенциал у метиленового синего любопытный. Возможно, он будет иметь свою точку приложения в лечении острых респираторных инфекций, например, на старте болезни. Но прежде, чем уверенно говорить о каких-то противовирусных эффектах препарата, нужно провести новое полномасштабное исследование на гораздо большей когорте людей.

Об эксперте: Игорь Решетов — доктор медицинских наук, директор Института кластерной онкологии имени Л.Л. Левшина Сеченовского университета. Академик РАН.

«По всей видимости, у этого препарата действительно имеется универсальный механизм уничтожения вирусов — не только SARS-CoV-2, но и вирусов гриппа и других респираторных патогенов».

Ученые уже подали заявку на грант. Если выиграют, то полученные деньги планируют потратить на организацию совместного исследования с НИИ медицинской приматологии в городе Сочи, где будут дальше изучать воздействие синего красителя на вирусы и иммунную систему на приматах.

Положительные результаты средства от ковида в разных странах

Впрочем, российские ученые не единственные, кто поверил в противовирусный потенциал метиленового синего. Исследования, в которых изучается механизм его работы против коронавируса и других респираторных патогенов, сегодня проводятся по всему миру: Иране, Германии, Канаде, США.

Кстати, одно из впечатляющих наблюдений было не так давно сделано во Франции. Там совершенно неожиданно выявили профилактическое противовирусное действие метиленового синего. С момента начала эпидемии COVID-19 в Страсбурге велось наблюдение за 2,5 тыс. французских пациентов, получавших метиленовый синий во время лечения рака. Несмотря на то, что в семьях некоторых из этих людей наблюдались вспышки короновирусной инфекции, никто из 2,5 тыс. онкобольных так и не заболел.
Хотите, чтобы ПЦР-тесты всегда выдавали в отношении вас на 100% отрицательный результат?
Хотите не болеть ковид 2019 или лечить его быстро, дешево,  без больниц и побочек?
Оказывается, это совсем нетрудно.
Ученые люди попробовали – получилось.

СТАРОЕ, ДОБРОЕ ЛЕКАРСТВО СПРАВИЛОСЬ С КОРОНАВИРУСОМ

1. Метиленовый синий (МС) – это давно известный медицинский препарат, который широко применяется еще с 19 века при терапии различных заболеваний, например, малярии, психозов, болезни Альцгеймера.
2. В простонародье – «синька».
3. В аптеке – метилтиониния хлорид.
4. Вещество синтезировал в 1876 году немец Генрих Каро.
5. МС входит в список жизненно-важных препаратов по версии Всемирной организации здравоохранения -  как антидот при отравлении цианидами, угарным газом и сероводородом.
6. МС — мощный антиоксидант, который способен блокировать окислительный каскад в организме.
7. МС — противовоспалительное средство широкого спектра действия.
8. МС обладает и ярким противовирусным эффектом.

О научном открытии и испытании лекарства от коронавируса подробно

ВСЕ НАЧАЛОСЬ В 2018-ом
В 2018 году исследователи доказали, что МС инактивирует (делает неактивным) в плазме крови коронавирус MERS-CoV, вызывающий острый ближневосточный респираторный синдром (это, всего лишь, необычное поражение органов дыхания).
Поэтому не было удивительным то, что в 2020 году появилась идея попробовать эффективность МС и в лечении другого коронавируса - ковида 2019.
Она  принадлежит Институту кластерной онкологии имени Л.Л. Левшина на базе Университетской клинической больницы № 1 Сеченовского университета.
В период эпидемии институт был перепрофилирован под ковидный госпиталь.
Вот сеченовские онкологи и попробовали найти альтернативные методы лечения.

Сотрудники Сеченовского университета признаются, что им также помогла публикация китайских коллег, которые сообщили, что  при применении метиленового синего вкупе со световым облучением можно уничтожить коронавирус.

Кандидат медицинских наук, врач-хирург Артем Ширяев  с коллегами решили  попробовать использовать способность МС уничтожать ковид 2019 в плазме крови.
«Оказалось, что вирус погибал  при воздействии на него МС за считанные минуты.   
Это и помогло нам разработать свой протокол лечения», - говорит Ширяев.

Испытать решили на себе, поскольку бояться нечего – препарат давно зарекомендовал себя как абсолютно безопасный.
Главное было рассчитать дозу, которой хватило бы, чтобы убить вирус.
Доктор физико-математических наук, профессор Института общей физики им. А.М. Прохорова РАН Виктор Лощенов рассказал, что исследования пришлось проводить дома, поскольку в Москве был введен режим самоизоляции.

«Я исследовал фармакокинетику МС на себе и добровольцах», - дополнил коллегу Лощенов.
То есть  первыми, ещё до начала исследования, МС приняли сами авторы эксперимента.

Утверждение исследования состоялось в апреле, а уже на следующий день МС предложили использовать на добровольцах, проходящих лечения от ковида.
Лечение проходило в течение месяца – с 25 апреля по 25 мая, в нем приняло участие 49 человек с подтвержденным диагнозом COVID-19 и поражением легких от 25 до 75% и 39 добровольцев – в основном, это врачи, работавшие в «красной» зоне поликлиники.

Все добровольцы принимали препарат еженедельно (раз в неделю), выпивая индивидуально рассчитанную дозу метиленового синего, разведенного в стакане воды.

Пациенты с диагнозом COVID-19 кроме стандартного лечения получали МС в виде ингаляций и перорально в сочетании с фотодинамической терапией.
Врачи с помощью светодиодной установки воздействовали красным светом с длиной волны 665 нм на зону носоглотки и груди.
Благодаря этому, воздействие метиленового синего усиливалось в десять раз.

Эффект лекарства от коронавируса оказался впечатляющим.

Уже на следующий день многие пациенты наблюдали снижение температуры с 39°С до 36,6°С.
Полностью возвращалось утраченное обоняние, исчезли боли в груди, вновь появлялась способность дышать, отмечалась положительная динамика по КТ - исчезал эффект матового стекла.
На 10 и 12 день после госпитализации повторный ПЦР-тест  не обнаружил вирус ни у одного из участников исследования, включая группу добровольцев.
Но что не менее важно, ни у одного добровольца после приема МС не было обнаружено каких-либо побочных явлений.

Директор Института кластерной онкологии Сеченовского университета и академик РАН Игорь Решетов называет потенциал МС любопытным.
«По всей видимости, у этого препарата действительно имеется универсальный механизм уничтожения вирусов — не только SARS-CoV-2, но и вирусов гриппа и других респираторных патогенов.
Но  о чудодейственном эффекте метиленового синего мы просто не имеем права говорить — пока сделаны лишь первые испытания», - объясняет Решетов.
Ученые подали заявку на грант для дальнейшего и подробного исследования лечения ковида 2019 с помощью синьки.
В то же время они обращают внимание на то, что аналогичные исследования проводят в Иране, Германии, США, Канаде и Франции.

Одно из впечатляющих наблюдений было не так давно сделано во Франции.
Там также совершенно неожиданно для себя выявили профилактическое противовирусное действие МС.
С момента начала эпидемии COVID-19 в Страсбурге велось наблюдение за 2,5 тыс. французских пациентов, получавших МС во время лечения рака.
Несмотря на то, что в семьях некоторых из этих людей наблюдались вспышки короновирусной инфекции, никто из 2, 5 тыс. онкобольных так и не заболел.

КАК ОТРЕАГИРОВАЛИ ПОЛИТИЧЕСКИЕ ВЛАСТИ НА ОТКРЫТИЕ ПРЕПАРАТА ОТ КОРОНАВИРУСА?

Политики твердо исповедуют главный догмат коронаверия: «Ничто не спасает от коронавируса, кроме вакцины».
Все остальное, по их мнению,  «от лукавого».
Но, все-таки, косвенно они признали победу сеченовских медиков.

Потому что 17 сентября  2021 год именно в парке Клинического городка Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова власти установили монумент «Подвигу медицинских работников в борьбе с COVID-19».

При этом факт отыскания медиками лекарства ни, конечно же, проигнорировали.
Главный короноборец Собянин на открытии памятника отметил, что заслуга медицинских работников – это почти 1, 5 млн. вылеченных от коронавируса москвичей.
Министр здравоохранения России Михаил Мурашко и зам. председателя Правительства России Татьяна Голикова также скромно промолчали насчет открытия медиками невероятно мощного действия синьки на ковид 2019. 

А ЧТО МЕДИЦИНСКИЕ ВЛАСТИ ОТВЕТИЛИ НА ОТКРЫТИЕ АНТИКОВИДНОГО СРЕДСТВА?

С начала пандемии Всемирная организация здравоохранения и представители Big Farma заняты поисками эффективного лекарства от ковида 2019 COVID-19.
Именно поэтому и было санкционировано эксперименты по применению некоторых медикаментов по всему миру.

Поскольку создание нового препарата — дело не быстрое, а людей по всему миру необходимо лечить, было разрешено применять препараты по показаниям, не утверждённым государственными регулирующими органами и не упомянутым в инструкции по применению (так называемые медикаменты Off-label).

Именно на таких условиях и были использованы при лечении коронавируса нашумевший гидроксихлорохин,  фавилавир и многие другие лекарства, которые предназначены для совершенно других болезней.

И вдруг такая сенсация – копеечное медицинское средство (10-20 рублей за дозу) может вылечить человечество от ковида.
Причем МС  не только убивает сам вирус, но и способен восстанавливать многие функции организма, борясь с последствиями болезни.

Конечно же, медицинские власти обрадовались!
И немедленно профинансировали срочные  дальнейшие исследования МС против ковида 2019 COVID-19 по всему миру!

Что, поверили?
Неужели поверили?!
Увы, они, как обычно, проигнорировали открытие реального народного, общедоступного лекарства.
Именно потому, что найденное лекарство слишком доступно и дешево, слишком эффективно и может применяться без врачей.

Медицинские власти опять применили старое, надежное, проверенное средство борьбы с эффективными и недорогими, народными лекарствами:  забвение и замалчивание.
Увыы, МС не сулит властям ни барышей, ни славы.

СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА ОТ КОРОНАВИРУСА

Метиленовый синий принимают разными способами.
Внутривенно.
Такой способ используют для снижения болевого синдрома, для снятия низкого давления, шока после операции.
Интрапаренхиматозно.
Это способ введение красителя непосредственно в ткань органа. Его используют, например, для картирования лимфатических узлов, для визуализации опухолей.
Перорально.
Например, при лечении малярии.

Метиленовый синий — безопасный препарат в терапевтической дозе менее 2 мг на 1 кг. веса.
Когда уровни больше  7 мг / кг, будут возникать побочные эффекты, некоторые из которых могут быть летальны.
Например, серотониновый синдром (сверх высокий уровень серотонина).
Антидота к МС не существует.

А как принимать МС ингаляционно (вдыханием)?
Можно дышать над теплым водяным раствором  МС в кастрюле - как над теплой картошкой.
Возможно ли применение бытового ингалятора?
Гуглите и найдёте!

ТАК ЧТО ТАМ С ПЦР-ТЕСТАМИ?
После однократного ингаляционного применения метиленового синего с сопутствующей фотодинамической терапией уже на следующий день ПЦР-тест на SARS-CoV-2  может быть отрицательным.

Что такое ингаляция?
Дышим испарениями МС (см. ниже, я попробовал, отчитываюсь).

Что такое фотодинамическая терапия?
Воздействие светом, желательно красного цвета.
Например, от камина или красной лампы.
Можно применять лазерную указку с красным светом, но точечное воздействие менее эффективно.

Вот цитата:

«Когда приходили пациенты с положительным тестом ПЦР на коронавирус, мы предлагали этот метод лечения через ингаляционное применение метиленового синего и облучение лазером ротоглотки и полости носа.
На следующий день мы брали мазок у этих пациентов: тест на ПЦР.
И у всех пациентов, которым мы провели данный тип лечения для эрадикации этого вируса, на следующий день мы получили отрицательный результат.
То есть эрадикация вируса была у этих пациентов через сутки стопроцентная!» — рассказывает Артем Ширяев.

МОЙ СПОСОБ ИНГАЛЯЦИИ
Начал осваивать МС.
С остоожностью.
Хочу проверить - как он влияет на общий иммунитет, работоспобность.
Болею диабетом 2 типа, потому нуждаюсь в постоянном лечении.
Я не принимал его перорально (в виде жидкости через рот).
Только вдыхал пары.

Результаты впечатлили с первого же дня.
Да что там дня!
После первой же вечерней, однократной процедуры произошло явное, заметное улучшение состояния в течение 20-30 минут.

Прояснились глаза, изменилось восприятие мира.
Укрепились ноги.
Через пару часов из стоп и кистей ощутимо ушел застой, суставы «помолодели».
Утром встал как огурчик - как в детстве.

Улучшение  держалось примерно сутки.
Затем часть улучшения пропала, но некоторая часть, все-таки, осталась.

Затем дня три делал так:  дышал в течение дня через каждые несколько часов - делал несколько вдохов (от 3 до 7) - то ртом, то носом, максимально глубоко.
После каждого сеанса состояние улучшалось, работоспособность увеличивалась.

Через три дня начала поднялась из глубин легких и начала отхаркиваться какая-то слизистая коричневая дрянь (длилось примерно сутки).
На четвертый день начала немного болеть голова, потому решил на сутки-двое прекратить процедуры.
Что будет дальше - отпишусь.

Вот что я сделал для простой, эффективной регулярной ингаляции.
Терапия должна быть удобной и быстрой.
Наливаем немного спирта в небольшую стеклянную банку (0, 3 - 0, 5 литра) - 1 столовую ложку (если водка - две столовые ложки).
Затем туда же – весь бутылек МС из аптеки (1% раствор, 25 мл., метилтиониния хлорид).
Можно добавить несколько капель свежего чесночного сока.
Можно еще добавить несколько капель (не больше!) хвойного масла (кедровое, пихтовое или сосновое - нужно покупать самое дорогое, там есть хоть чуть-чуть натурального).

Банка должна быть постоянно под рукой.

Еще сделал слабый водный раствор синьки (светло-голубой), полоскаю горло перед сном  и чищу им зубы, применяя вместо зубной пасты – процедура секунд 10-15, не больше.

Вот и все что я делаю - для профилактики и укрепления общего иммуниетета.
Вывод: это работает, точно!
За несколько дней работоспособность ощутимо повысилась, мозги стали работать лучше, сон также улучшился.
Но следует постоянно следить за состоянием организма, делать перерывы в лечении, если возникают проблемы.

Если перорально, то только курсами -  1-3 недели, весной и осенью.
А если в форме ингаляции, как я описал, то возможен и длительный прием 1-2 месяца, ежедневно, поскольку количество принимаемого с испарениями МС ничтожно мало и он не будет всерьез накапливаться.

ОБОБЩАЮЩИЕ СВЕДЕНИЯ (Сеченовский университет)
1. Метиленовый синий (МС) практически единственный разрешенный к клиническому применению препарат, который защищает нейроны за счет механизма дезактивации резидентных макрофагов (микроглии).

2. Единственный препарат, защищающий клетки от пагубного воздействия коронавируса на процесс кислородного дыхания за счет механизма разблокировки участка дыхательной цепи (цитохром-с-оксидазы) в митохондриальной мембране, что способствует быстрому восстановлению функциональной активности клеток.

3.  МС частично обезвреживает кислородсодержащие моноциты и макрофаги, которые являются причиной аутоиммунной атаки (так называемый «цитокиновый шторм») на различные органы, поврежденные коронавирусом (чаще всего в ткани легких, но могут быть и другие участки ткани - сосуды, почки, сердце, эндотелий кишечника и нервная ткань).
При световом облучении может их полностью дезактивировать, за счет фотодинамического эффекта.

4. МС обладает прямым цитотоксическим действием на коронавирус. Блокирует рецепторы ACE2. В то же время его эффективность многократно возрастает при освещении в красном спектральном диапазоне.

5. Препарат при пероральном приеме в дозе 1 мг / кг массы тела присутствует в организме в разрушительной для вируса концентрации в течение 2 - 2,5 дней даже без облучения (передозировка - более 5 мг / кг).

6. Препарат при ингаляционном введении покрывает поверхность слизистой оболочки носа, ротоглотки и эпителиальную ткань бронхов и блокирует рецепторы АСЕ2, которые являются наиболее уязвимыми с точки зрения вирусной атаки, а в присутствии вируса убивает его. При высокой вирусной нагрузке добавляется излучение в красном диапазоне спектра.

7. Это первое синтетическое лекарство в мире. Имеет долгую историю использования. В применяемых дозах практически отсутствуют побочные эффекты. Раньше активно использовался ВНУТРИВЕННО при отравлениях угарным газом, алкоголем и химическими реактивами.

8. По результатам исследования 2500 пациентов, принимавших метиленовый синий в дозе 1 мг / кг массы тела в качестве реабилитационной терапии после химиотерапии, ни один не заболел COVID-19 (Страсбург, Франция, 2020).

9. По приблизительным подсчетам, более чем 100 добровольцев, в том числе врачей из «красной» зоны, которые с марта по май 2020 года принимали метиленовый синий в профилактических целях, никто не заболел. С июня по август из более 250 человек принимавших МС, трое заболели в легкой форме, но быстро выздоровели. С сентября по октябрь из более 400 человек принимавших МС, пять человек заболели в легкой форме. Около 20 человек принимавших МС сразу после того, как заболели, выздоровели в течение 3-4 дней. Ни у кого не было побочных эффектов.

10. Получено разрешение на проведение ограниченных клинических исследований в клинике Сеченовского университета (руководитель - академик Решетов И. В.). Первый этап исследований был успешно завершен со 100% положительным результатом для пациентов с КT1, КT2, КT3 (поражение легких от 0 – 75%).

11. Он обладает свойством восстанавливать метгемоглобин до оксигемоглобина, что увеличивает насыщение крови кислородом пациентов и тем самым блокирует токсическое действие высвобождаемого железа в двухвалентной форме на стенки кровеносных сосудов.

12. Несовместим с сильнодействующими психотропными препаратами. 3 дня моча лазурного цвета.
Для профилактики принимать 1 мл (1% раствора) метиленового синего (МС) на 10 кг веса тела.
Развести в 150-200 мл воды (неминеральной).
Должно получиться 1 мг/кг веса тела.
Принимать 1 раз в 7 дней в период пандемии и в случае близкого контакта с заболевшим, но не чаще, чем 1 раз в 4 дня.
Одного 25 мл флакона хватает в среднем на 3 приема.
Смазывать носовые полости (не глубоко) ушной палочкой, смоченной в растворе, приготовленном для питья 2 раза в день во время болезни и 1 раз в 3 дня во время пандемии.
Если есть возможность посидеть у открытого огня (камин, костер), то это усиливает эффект лечения.
Полезен только свет от огня, излучаемое тепло не должно повышать температуру тела выше 37 градусов.

ОФИЦИАЛЬНАЯ ИНСТРУКЦИЯ
Состав и лекарственная форма

Препарат представляет собой метилтиониния хлорид — мелкокристаллический порошок темного зеленовато-синего цвета с легким блеском. В фармацевтической промышленности выпускается в виде спиртового раствора, фасуется в стеклянные флаконы объемом 25 мл. Реже метиленовый синий реализуется в натуральном виде — для приготовления водных растворов.

Механизм действия

Синька имеет свойство окрашивать жидкости, живые ткани и различные материалы.
При контакте с кожей, слизистыми организма средство оказывает бактериостатическое и антисептическое действие: связывает полисахариды и белки грамположительных микробов, блокируя их движение и распространение.
Наружное использование не приводит к всасыванию препарата в системный кровоток.
В жидкостной среде — плазме крови метиленовый синий проявляет себя как участник окислительно-восстановительных процессов, выделяя ионизированный водород.
Это позволяет использовать средство как противоядие при различных интоксикациях. Внутри организма составляющие лекарства не откладываются, фильтруются и выводятся почками.
В медицине препарат предназначен для местного применения при воспалительных процессах и повреждениях кожных покровов.
Но реальная сфера его использования шире.
Метилен используют:
- в качестве контрастного вещества при диагностических обследованиях;
- дезинфицируют им аквариумные аксессуары, корм для рыбок и воду;
- применяют при печати фотографий;
- в качестве натурального красителя для тканей;
- в системах водоочистки;
- в аналитической химии для выделения различных элементов и проведения опытов.
Метиленовый синий входит в перечень жизненно необходимых препаратов, как эффективный антидот.
Он вытесняет токсины при отравлениях цианидами, сероводородом, угарным газом. Исследования вещества показали, что оно способно приносить пользу при болезни Альцгеймера, диагностике раковых опухолей, вирусных инфекциях.
Предполагается, что прием препарата внутрь может оказать губительное действие на коронавирус, вызывающий COVID-19, а также возбудитель геморрагической лихорадки Эбола.
Кроме того, краситель четко выделяет патологические клетки и микроскопических паразитов в биоматериалах и крови.

Показания к применению

В качестве антисептического средства спиртовой раствор метиленового синего рекомендуется:
- при раздражение кожи;
- пиодермии;
- дерматитах и других воспалительных процессах;
- фурункулезе;
- поверхностных повреждениях покровов: потертостях, царапинах, ссадинах;
- при стоматитах: для обработки слизистой оболочки рта.

Водный раствор синьки рекомендован для приема внутрь: при цистите, уретрите, воспалении почек и других заболеваниях мочевыделительной системы.
При отравлениях цианидами, нитритами, производными анилина, окисью углерода и другими ядами раствор синьки применяют инъекционно.

Как применять метиленовый синий: инструкция

При наружном использовании готового препарата кожные покровы и слизистые очищают, при стоматитах рот прополаскивают водой.
Спиртовой раствор наносят на ватный тампон и аккуратно обрабатывают им края ран, царапины, воспаленные участки, захватывая область здоровой кожи.
Процедуру проводят 1–2 раза в сутки до эпителизации тканей.
Для приема внутрь порошок разводят в дистиллированной воде в соотношении: 2 г. на 1000 мл.
Максимальная доза в сутки: 500 мл раствора.
Детям метиленовый синий дают под врачебным контролем.
При интоксикациях используют раствор препарата на глюкозе или водный, в дозировке 1%. Антидот вводят внутривенно с помощью капельниц по 50–100 мл.
Длительность терапии во всех случаях определяют индивидуально.
Для обработки аквариумов метиленовый синий разводят в воде: 5–6 капель на 1 ст. л.
Затем добавляют раствор в аквариум: не более 1 мл препарата на 2,5 л воды.
Через 3–4 суток содержимое при необходимости можно обработать повторно.

Противопоказания и побочные эффекты

При наружном использовании синька редко вызывает нежелательные реакции.
Наиболее частые эффекты: раздражение кожи, зуд, жжение.
При обработке полости рта спиртовым раствором возможны ожоги.
В подобных случаях от использования препарата нужно отказаться.
Прием метиленового синего внутрь может вызвать бурную реакцию со стороны организма:
-  тошноту, рвоту, ухудшение аппетита;
-  колики в желудке и брюшной полости;
 - нарушение диуреза;
 - астению;
- физическую слабость;
- повышение потоотделения.
Впоследствии лечения препаратом может ухудшиться усвоение пищи и усвоение некоторых микроэлементов из нее.
Вероятно развитие анемии, обострение гастрита.
Метиленовый синий противопоказан детям младше 1 года.
Внутреннее применение запрещено при беременности и лактации.
Отказаться от использования необходимо также при аллергических реакциях.

 История создания вещества которое действует от коронавируса

От хинина до анилина а затем к эликсиру от ковида

Лечить малярию корой хинного дерева врачи додумались еще в XVII веке, если не раньше. Но означенное дерево росло только в Южной Америке, причем исключительно на склонах Анд, и к XIX веку стало окончательно ясно, что на весь мир запасов коры не хватит. Предприимчивые европейцы решили вывезти семена хинного дерева в Индию и Австралию, а правительство Перу, защищая свою монополию, шпионило за ними, устраивало на контрабандистов засады и бросало в тюрьмы. И пока перуанские правоохранители бегали за одними европейцами по предгорьям Анд, другие пытались получить хинин искусственным путем, чтобы не утруждать себя отношениями с южноамериканскими стражами порядка.

Один из них, Уильям Перкин, немного промахнулся с реакцией синтеза и получил на выходе фиолетовый раствор. Так появился первый синтетический анилиновый краситель — мовеин. Целебными свойствами хинина он не обладал, но стойко красил ткань в замечательный яркий цвет, и поэтому заставил других исследователей ринуться на поиск других синтетических красок.

 Через 20 лет, в 1876 году, немец Генрих Каро получил метиленовый синий. В отличие от анилиновых красителей, он не прижился в текстильной промышленности, зато быстро нашел свое место в лаборатории патологоанатома Карла Вайгерта, который приспособил его для окрашивания гистологических срезов — а оттуда уже попал к кузену Вайгерта, начинающему иммунологу Паулю Эрлиху.

Именно метиленовый синий приблизил ученого к Нобелевской премии: освоив новый краситель, Эрлих научился различать в мазке крови отдельные типы клеток. От препаратов он быстро перешел к экспериментам с животными и обнаружил, что метиленовый синий особенно хорошо оседает в нервных волокнах и головном мозге. Исходя из этого, Эрлих предположил, что краситель может работать анальгетиком и блокировать передачу болевых сигналов — что вскоре подтвердил на практике. Вместе с коллегой-психиатром Артуром Эппманном Эрлих задумывался и о том, что метиленовый синий можно было бы использовать и при психических расстройствах — но они так и не решились сделать следующий шаг и проверить эту идею на людях.

Тем временем, оказалось, что синий краситель годится не только для животных тканей, но и для паразитов — в том числе, для того самого малярийного плазмодия, который оставался непобежденным. Тогда Эрлих высказал новую идею: если краска накапливается внутри паразита в таких количествах, что выделяет его на фоне других клеток, то она может оказаться для него губительной — подобно тому, как, связываясь с болевым волокном, она тормозит передачу импульса. И действительно, вскоре, в 1891 году, Эрлиху вылечил с помощью метиленового синего двух больных малярией. Так метиленовый синий стал первым лекарством, синтезированным искусственно.

Синяя краска была не самым надежным средством от малярии. Но, за неимением лучшего, продержалась на позиции спасительного средства еще сорок лет, пока усилиям химиков-органиков не поддался наконец настоящий хинин и его производные (самый известный из которых — хлорохин). Метиленовым синим лечили, например, солдат во времена мировых войн, а те были жутко недовольны, поскольку, кроме малярийного плазмодия, лекарство окрашивало в характерный цвет белки глаз, кожу и мочу.

Впрочем нелюбимый солдатами побочный эффект был скорее на пользу — позволял проследить, действительно ли пациент принял лекарство. Поэтому метиленовый синий использовали для контроля за приемом таблеток в психиатрических клиниках, где пациенты особенно ненадежны. И до сих пор продолжают применять в странах Африки. Особенно удобно назначать краситель детям: по синим каплям на одежде или подгузнике всегда видно, чьи родители честно выполняют назначения врача.

Три кольца или о химических свойствах средства от коронавируса

Эрлих и Эппманн не рискнули проверить действие метиленового синего на людях с психиатрическими диагнозами. Их итальянский коллега, Пьетро Бодони, оказался смелее: в 1899 году он накормил красителем 14 пациентов с психозом и отчитался — все они быстро успокоились.

Впрочем, опыты Бодони не вызвали большого ажиотажа, и возможно, метиленовый синий так и не привлек бы внимания психиатров, если бы не его родственники. В попытках получить другие противомалярийные препараты химики произвели на свет целую линейку веществ того же семейства — фенотиазинов. Все они от плазмодия спасали с трудом, зато неплохо помогали успокоить пациентов перед операцией. Самый, пожалуй, известный из них — хлорпромазин — до сих пор используют как транквилизатор в психиатрических клиниках.

В основе всех фенотиазинов (и метиленового синего в том числе) лежат три кольца: два чисто углеродных, ароматических, и еще одно с вкраплениями азота и серы. Такая структура, с одной стороны, делает эти вещества гидрофобными и помогает им проходить через мембрану клеток, а значит, преодолевать барьер между кровью и нервной тканью мозга. С другой стороны, своими кольцами они похожи на моноаминовые нейромедиаторы, например, дофамин и серотонин. Поэтому фенотиазины способны связываться с разными рецепторами для нейромедиаторов и с веществами, которые участвуют в их обмене (например, моноаминоксидазой) — а значит, могут влиять на передачу сигналов в мозге и его работу.

Среди своих психоактивных родичей метиленовый синий лучше всех изучен и проверен временем. Поэтому, как только стало ясно, на что способны фенотиазины, синий краситель бросились проверять на другие неожиданные неврологические качества. Метиленовый синий пытались применять при разных видах психоза, обнаружили у него (как и у других блокаторов моноаминоксидазы) свойства антидепрессанта и даже замахнулись было на шизофрению. Правда, до сих пор не появилось никаких убедительных данных о том, что краситель как-то от нее помогает.

Позже метиленовый синий, конечно, проверили и против болезни Альцгеймера. Выяснилось, что он мешает молекулам белка тау собираться в токсичные агрегаты внутри нейронов — и это дало основу для клинических испытаний терапии, которые идут сейчас.

Кроме того, оказалось, что метиленовый синий повышает результаты тестов на когнитивные функции не только у тех, кто лечится от деменции, но и у здоровых людей — по крайней мере, в том, что касается концентрации внимания и рабочей памяти. Так метиленовый синий стал еще и кандидатом в ноотропы и объектом внимания биохакеров. Впрочем, даже они не забывают напоминать, что технология еще не отработана, а при передозировке возможны побочные эффекты — например, серотониновый синдром, который в редких случаях смертелен.

Жонглируя электронами, как лекарство от "короны" помогает от других болезней

Когда Эрлих заметил, что его новая краска скапливается в нервных тканях, он еще не знал о существовании моноаминоксидазы и нейромедиаторов. У него на этот счет была своя теория. Он довольно быстро выяснил, что метиленовый синий может работать как окислитель и восстановитель: он может отдать электрон, теряя при этом цвет, а потом становится синим снова, если отберет электрон у кислорода. Именно поэтому, думал Эрлих, краситель тяготеет к нервной ткани — она потребляет много кислорода, а значит, там есть запас электронов.

Кое в чем Эрлих снова оказался прав. Метиленовый синий действительно вступает в окислительно-восстановительные реакции (поэтому, например, окрашенные им ткани синеют на воздухе, а потом постепенно блекнут). Именно это свойство — в нужный момент поделиться своими электронами и вызвать в клетке окислительный стресс — позволило ему победить малярийного плазмодия, а затем и других паразитов. Поэтому сегодня, например, врачи прописывают метиленовый синий для лечения бактериальных урологических инфекций.

Это же свойство — отдавать электроны — оказалось полезно и в другом контексте, при метгемоглобинемии. Метгемоглобин — это форма гемоглобина, в которой он не может связывать кислород, поскольку железо в его составе находится в неправильной степени окисления (не +2, как обычно, а +3). Такая форма может возникать и в норме, но обычно составляет несущественный процент от всего гемоглобина в эритроцитах. А вот при отравлении некоторыми веществами такого гемоглобина становится много, и насыщение крови кислородом резко падает. От этого как раз и спасает метиленовый синий, отдавая атому железа свой электрон.

В редких случаях метгемоглобинемия бывает наследственной — тогда дефицит кислорода становится постоянным, а кожа человека приобретает синеватый оттенок. Такие формы тоже лечат с помощью метиленового синего: именно он, как это ни парадоксально, помог порозоветь семейству синих людей из Кентукки, которые передавали метгемоглобинемию из поколения в поколение.

На этом достижения метиленового синего не заканчиваются. Благодаря своим электронам — то лишним, то недостающим — он блокирует производство двух важных провоспалительных веществ: оксида азота и арахидоновой кислоты. Поэтому его можно применять в самых разных случаях, когда речь идет об избыточном воспалении: при анафилактическом и септическом шоке, при пониженном давлении и ишемии, его пробовали использовать даже при приапизме и анальном зуде. Неудивительно, что о нем снова вспомнили и в начале коронавирусной пандемии: первая фаза клинических испытаний метиленового синего против COVID-19 должны завершиться в сентябре.

Метиленовый синий (лат. Methylenum coeruleum; N,N,N',N'-тетраметилтионина хлорид тригидрат, 3,7-бисдиметиламинофенотиоцианит хлорид, метиловая синь, метиленовый голубой) — краситель. Представляет собой тёмно-зеленые кристаллы с бронзовым блеском.

Брутто-формула (система Хилла): C₁₆H₁₈ClN₃S или в виде кристаллогидрата C₁₆H₁₈ClN₃S·H₂O.

Метиленовый синий был впервые синтезирован в 1876 году Генрихом Каро, работавшим на BASF. Тем самым он положил начало развитию химии фенотиазинов.

Физические свойства

Малорастворим в воде, этаноле, практически нерастворим в диэтиловом эфире и хлороформе. Легко восстанавливается: E₀ = +0,53 В. В водных растворах мономерная форма поглощает свет при длине волны λ_max = 668 нм, димер — в λ_max = 612 нм; константа димеризации К_дим = 5,00⋅10³ (pH 4—5,5).

Получение

Получают из N,N-диметиланилина.

Применение

Микроскопический фиксированный окрашенный по Романовскому — Гимзе препарат мазка крови больного трёхдневной малярией. В эритроцитах видны незрелые и зрелые трофозоиты Plasmodium vivax

Органический основной тиазиновый краситель, применяется для окраски хлопка, шерсти и шёлка в ярко-голубой цвет, однако краска разрушается на свету. В аналитической химии применяется для определения хлоратов, перхлоратов, катионов ртути, олова, магния, кальция, кобальта, кадмия.

В медицине используется в качестве антисептика для лечения инфекций ротовой полости и мочеполовых путей. Относится к списку жизненно важных препаратов ВОЗ для лечения метгемоглобинемии (антидот при отравлении цианидами, угарным газом и сероводородом). Имеются сообщения о высокой эффективности этого соединения при лечении болезни Альцгеймера. В онкологии это мощный фотосенсибилизатор, особенно активно работающий при воздействии света и способствующий разрушению патологических клеток.

Используют в микроскопии как красящее вещество, так как метиленовый синий интенсивно окрашивает некоторые ткани живого организма. Чеслав Хенцинский, работая в Одесском медицинском университете разработал на его основе с использованием эозина в 1888 году метод двойного окрашивания клеток крови и кровяных паразитов, позволившего выявлять паразитов крови, в частности возбудителей малярии и в 1889 году защитил по этой теме докторскую диссертацию «К учению о микроорганизмах малярии». Впервые его использовал для окраски нервной ткани (1889) М. Д. Лавдовский.

В результате этих разработок он стал первым применённым в медицине веществом, несуществовавшим до этого в живой природе.

В аквариумистике применяется довольно часто во время инкубирования икры в качестве антисептика.

В водоочистке применяется при тестировании активированного угля по ГОСТ 4453-74.

В фотографии может использоваться как десенсибилизатор в значительном разведении. В высокой концентрации вместо десенсибилизирующего действия оказывает вуалирование.

Метиленовый синий давно используется в медицине в качестве антидота против некоторых токсинов. Метиленовый синий имеют потенциал в качестве симптоматического лечения лечения сепсиса.

Летом 2020 года в российских популярных СМИ появились публикации о том, что испытания на людях показали, что водный раствор красителя метиленовый синий, применяемый либо внутрь, либо ингаляционно, может достаточно быстро уничтожить в организме коронавирус SARS-CoV-2. Также, согласно этим публикациям, раствор метиленового синего усиливает свою активность в 10 раз при воздействии красного света (фотодинамической терапии) с длиной волны 665 нм на зону носоглотки и груди. Учитывая, что речь идёт всего лишь о публикациях в популярных СМИ, а не в научных журналах, и что полноценное клиническое исследование так и не было проведено, к теории об эффективности лечения коронавирусной инфекции данным методом необходимо подходить крайне осторожно.

Также метиленовый синий используется при отравлении угарным газом, для лечения метгемоглобинемии, инфекций мочеполовой системы, септического шока, малярии и как противовирусный препарат.

Противопоказания

Метиленовый синий является ингибитором моноаминоксидазы, поэтому его внутреннее применение на фоне приёма антидепрессантов группы селективных ингибиторов обратного захвата серотонина может привести к развитию серотонинового синдрома

Пиперин от ковида (черный перец)

 Ученые из Института цитологии РАН и Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера выяснили, что содержащееся в черном перце вещество пиперин способно блокировать распространение COVID-19, результаты исследования опубликованы в журнале Biomedicines. Как объяснила в беседе с "Ведомостями" одна из авторов научной работы главный научный сотрудник ИНЦ РАН Ольга Остроумова, один из способов снижения темпов распространения коронавируса — это создание препаратов, блокирующих белки на поверхности клетки человека, к которым прикрепляется возбудитель инфекции для дальнейшего проникновения. При этом COVID-19 постоянно и быстро мутирует. Это приводит к тому, что белки, с помощью которых вирус проникает в клетки, могут постоянно меняться, из-за чего со временем такие препараты теряют свою эффективность. Поэтому российские ученые решили заняться изучением веществ, способных заблокировать не белковое взаимодействие, а слияние липидных оболочек (мембран) клеток человека и коронавируса — это обязательное условие проникновения вируса в клетку, пояснила специалист.

"Для этого использовались алкалоиды растительного происхождения. Например, наиболее эффективное соединение — пиперин — содержится в черном перце, давно известен и используется в составе биоактивных добавок для различных медицинских целей", — заявила Остроумова. Для эксперимента отобрали 20 различных алкалоидов. При тестировании на моделях вирусных и клеточных мембран в присутствии фрагмента белка коронавирусной инфекции, который отвечает за слияние, наибольшую эффективность из них показал пиперин. После этого ученые из Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера провели тесты вещества на уханьском штамме коронавируса и клетках обезьян. Исследователи пришли к выводу, что пиперин изменяет свойства вирусной липидной оболочки. В результате, она теряет способность сливаться с мембранами клеток человека, и вирус не может проникнуть внутрь клеток, благодаря чему прекращается распространение COVID-19, отметила Остроумова.

Она также добавила, что коронавирус не сможет стать устойчивым к пиперину, поскольку мутации вируса практически не затрагивают его липидную оболочку, а целиком избавиться от нее вирус не может, поскольку это несовместимо с его жизнедеятельностью. Кроме того, отмечается, что изученные в институте алколоиды могут стать основой для создания эффективных БАДов для профилактики и терапии новой коронавирусной инфекции. 

Растительные алкалоиды ингибируют слияние мембран, опосредованное кальцием и фрагментами пептидов слияния MERS-CoV и SARS-CoV / SARS-CoV-2

к Егор Васильевич Шекунов 1ORCID,Светлана Сергеевна Ефимова 1, ORCID,Наталья Михайловна Юдинцева 1,Анна Анатольевна Мурылева

2,Зарубаев Владимир Васильевич 2ORCID,Александр В. Слита 2ORCID а такжеОстроумова Ольга Сергеевна 1

1 Институт цитологии РАН, ул. Тихорецкого, 4, 194064 Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Мира, 14, 197101 Санкт-Петербург, Россия

Автор, к которому следует обращаться.

Академический редактор: Драшар Павел Борисович

Biomedicines 2021 , 9 (10), 1434;

Поступила: 26 августа 2021 г. / Доработана: 30 сентября 2021 г. / Принята в печать: 7 октября 2021 г. / Опубликовано: 10 октября 2021 г.

(Эта статья относится к специальному выпуску « Терапевтический потенциал вторичных метаболитов растений в лечении заболеваний и разработке лекарств» )

Чтобы рационализировать противовирусное действие растительных алкалоидов, была исследована способность 20 соединений ингибировать опосредованное кальцием слияние липидных пузырьков, состоящих из фосфатидилглицерина и холестерина, с использованием анализа высвобождения кальцеина и динамического светорассеяния. Пиперин, таберсонин, горденин, люпинин, хинин и 3-изобутил-1-метилксантин продемонстрировали наиболее сильные эффекты (индекс ингибирования более 50%). Введение фосфатидилхолина в смесь фосфатидилглицерин / холестерин привело к значительным изменениям эффективности хинина, горденина и 3-изобутил-1-метилксантина. Сравнение ингибирующей способности исследуемых алкалоидов к слиянию, и результаты измерений вызванных алкалоидами изменений физических свойств модельных мембран показали сильную взаимосвязь между снижением кооперативности фазового перехода липидов и способностью алкалоидов предотвращать опосредованное кальцием слияние везикул. Чтобы использовать эти знания для борьбы с новой пандемией коронавируса, была изучена способность наиболее эффективных соединений подавлять слияние мембран, вызванное фрагментами слитых пептидов MERS-CoV и SARS-CoV / SARS-CoV-2 с использованием анализа высвобождения кальцеина. конфокальная флуоресцентная микроскопия. Было показано, что пиперин ингибирует слияние везикул, опосредованное обоими пептидами коронавируса. Более того, было показано, что пиперин значительно снижает титр потомства SARS-CoV2 in vitro в Способность наиболее эффективных соединений подавлять слияние мембран, вызванное фрагментами слитых пептидов MERS-CoV и SARS-CoV / SARS-CoV-2, изучалась с помощью анализа высвобождения кальцеина и конфокальной флуоресцентной микроскопии. Было показано, что пиперин ингибирует слияние везикул, опосредованное обоими пептидами коронавируса. Более того, было показано, что пиперин значительно снижает титр потомства SARS-CoV2 in vitro в Способность наиболее эффективных соединений подавлять слияние мембран, вызванное фрагментами слитых пептидов MERS-CoV и SARS-CoV / SARS-CoV-2, изучалась с помощью анализа высвобождения кальцеина и конфокальной флуоресцентной микроскопии. Было показано, что пиперин ингибирует слияние везикул, опосредованное обоими пептидами коронавируса. Более того, было показано, что пиперин значительно снижает титр потомства SARS-CoV2 in vitro вКлетки Vero при использовании в нетоксичных концентрациях. Ключевые слова: алкалоиды ; мембранный слияние ; ингибитор слияния вирусов ; противовирусная терапия ; COVID-19

1. Введение

     Более трети соединений, одобренных FDA, являются натуральными веществами растительного происхождения или их производными [ 1 ]. Растительные соединения играют важную роль в фармацевтической промышленности из-за их безопасности и относительной дешевизны [ 2 , 3 , 4 ]. Алкалоиды - это широкий класс азотсодержащих соединений с основными свойствами, насчитывающий более 8000 представителей [ 5 ]. Алкалоиды демонстрируют множество биологических активностей, включая противовирусное [ 6 ], антибактериальное [ 7 ] и противогрибковое [ 8 ]. Алкалоиды были показаны , чтобы быть эффективными против Retroviridae [ 9 , 10 , 11, 12 ], Togaviridae [ 13 ], Herpesviridae [ 14 , 15 ], Flaviviridae [ 16 , 17 , 18 , 19 ], Filoviridae [ 20 ] и Orthomyxoviridae [ 21 , 22 ]. В связи с глобальной эпидемиологической ситуацией особый интерес представляет способность алкалоидов эффективно бороться с вирусами семейства Coronaviridae , включая SARS-CoV-2 [ 23 , 24 , 25 , 26, 27 30]. Использование алкалоидов против COVID-19 недавно было изучено в клинической практике [ 28 ]. В литературе указывается, что механизмы противовирусной активности алкалоидов плейотропны. Например, подавление ВИЧ алкалоидами, фагаронином, нитидином, колумбамином, берберином, пальматином и коралином опосредуется ингибированием обратной транскриптазы [ 29 ], в то время как противовирусная активность против вируса гепатита B связана со снижением активности вируса гепатита B. белок p38 MAPK []. Обширная противовирусная активность алкалоидов может указывать на более общий и фундаментальный механизм их действия. Многие вирусы (вирус гриппа, ВИЧ, SARS-CoV-2, вирус Эбола, вирус Зика и др.), Против которых эффективны алкалоиды, имеют оболочку, т. Е. Содержат липидную мембрану [ 31 ]. Слияние вирусной и клеточной мембран является необходимой стадией цикла развития вируса, и блокирование этой стадии является эффективной терапевтической стратегией [ 32 ]. В настоящее время существует несколько работ, посвященных ингибированию слияния вирусов посредством алкалоид-пептидных взаимодействий [ 33 , 34 ]. Было обнаружено, что алкалоиды могут ингибировать слияние вирусов посредством взаимодействия с клеточными факторами [ 35 ] и вирусными белками [17 , 18 , 25 , 26 , 36 ]. Однако вклад липидной матрицы и ее биофизических свойств в слияние остается недооцененным [ 37 , 38 ]. Исследования, посвященные изучению ингибиторов слияния, нацеленных на физические свойства вирусных и клеточных мембран, все еще недостаточны [ 39 ].

    

   Модельные липидные бислои обычно используются для рационализации и лучшего понимания процесса слияния мембран [ 40 , 41 , 42 ]. А именно, использование систем с заданными физическими параметрами обеспечивает точную интерпретацию результатов и позволяет выявить молекулярные основы исследуемых процессов [ 42 , 43 , 44 ].

    

   Целью данной работы было определить, связана ли противовирусная активность алкалоидов со способностью ингибировать слияние вирусной и клеточной мембран. Была оценена способность 20 структурно различных алкалоидов ингибировать индуцированное кальцием слияние липидных везикул и изучена зависимость ингибирующей активности алкалоидов от липидного состава сливающихся липосом. Чтобы продемонстрировать взаимосвязь между изменениями физических свойств липидной матрицы и подавлением слияния мембран под действием алкалоидов, были также оценены вызванные алкалоидами изменения в трансмембранном распределении латерального давления и электростатического потенциала. Чтобы показать, что полученные данные могут иметь прямое значение для клинической практики с точки зрения использования растительных алкалоидов в качестве ингибиторов слияния, Дополнительно была протестирована способность алкалоидов ингибировать слияние липидных везикул, вызванное критическими фрагментами слитых пептидов MERS-CoV и SARS-CoV / SARS-CoV-2. Наиболее эффективное соединение, пиперин, также было оценено на предмет противовирусной активности in vitro против SARS-CoV-2 дляКлетки Vero .

    

    

2. Материалы и методы

     2.1. Материалы

    

   Все использованные химические вещества были реактивными. Синтетический 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-rac-глицерин) (DOPG), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC), 1-пальмитоил-2- олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC), сфингомиелин (мозг, свинья) (SM), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо- (1'-rac-глицерин) (DPPG), холестерин (CHOL) и 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- (лиссамин родамин B сульфонил) (Rh-DPPE) были получены от Avanti ® Polar Lipids. Нонактин, KCl, CaCl 2, PEG-8000, кальцеин, Triton X-100, Sephadex G-50, HEPES, DMSO, фосфатный буферный раствор (PBS), сорбитол и алкалоиды, атропин, (-) - люпинин, (-) - котинин, берберин хлорид, хинин, мелатонин, кофеин, 1,7-диметилксантин, 3,9-диметилксантин, теофиллин, 3-изобутил-1-метилксантин, 7- (β-гидроксиэтил) теофиллин, пентоксифиллин, горденин, (±) -синефкапринзаикицин, колхицин , дигидрокапсаицин и таберсонин были приобретены у Sigma-Aldrich Company Ltd. (Gillingham, UK). Химические структуры протестированных алкалоидов представлены на Рисунке S1 ( Дополнительные материалы ).

    

   Культуральные среды DMEM и DMEM / F12, фетальная бычья сыворотка (FBS), раствор трипсина и фосфатный буферный раствор Дульбекко (DPBS) были приобретены у Gibco TM (Life Technologies, Пейсли, Шотландия).

    

   Моделирующие гибридные пептиды FP-SARS-CoV-2 (RSFIEDLLFNKVT) и FP-MERS-CoV (RSAIEDLLFDKVT) были синтезированы компанией IQ Chemical LLC (Санкт-Петербург, Россия). Чистота пептидов ≥98%.

    

   2.2. Анализ утечки кальцеина

    

   Выбор мембранообразующих липидов связан с обогащением липидной оболочки вируса отрицательно заряженными и нейтральными глицерофосфолипидами, ХОЛ и СМ [ 45 , 46 , 47]. Небольшие однослойные везикулы получали из смесей ДОПГ / ХОЛ (80/20 мол.%), ДОФХ / ДОПГ / ХОЛ (40/40/20 мол.%) И ПОФХ / SM / ХОЛ (60/20/20 мол.%). методом экструзии. Полученная суспензия липосом содержала 3 мМ липида. Липидный раствор в хлороформе сушили в слабом потоке азота. Сухую липидную пленку гидратировали буфером (35 мМ кальцеин, 10 мМ HEPES, pH 7,4). Суспензию подвергали пяти циклам замораживания-оттаивания, а затем 13 раз пропускали через поликарбонатную мембрану с ядрами 100 нм. Кальцеин, который не был захвачен везикулами, удаляли гель-фильтрацией на колонке с Сефадексом G-50 для замены буфера вне липосом раствором, не содержащим кальцеина (0,15 М NaCl, 10 мМ HEPES, pH 7,4). Кальцеин внутри везикул очень слабо флуоресцирует из-за сильного самотушения при миллимолярных концентрациях.41 ].

    

   Здесь CaCl 2 и PEG-8000 были использованы в качестве широко известных индукторов слияния [ 48 , 49 , 50 , 51 ]. Результаты добавления различных концентраций CaCl 2 в водные растворы, купание в липосомах DOPG / CHOL (80/20 мол.%) И DOPC / DOPG / CHOL (40/40/20 мол.%), Нагруженных кальцеином, показаны на рисунке S2a. , b ( Дополнительные материалы ) соответственно. Более того, 20 и 40 мМ CaCl 2 использовали для индукции слияния липосом DOPG / CHOL и DOPC / DOPG / CHOL соответственно.

    

   Исследование структуры / функции, проведенное [ 49 ], показало, что фрагмент субъединицы S2 шипового белка БВРС-КоВ (RSARSAIEDLLFDKV), который является высококонсервативным во всем семействе коронавирусов, индуцирует образование синцития липосомы

    

   дипальмитоилфосфатидилхолина / SM / CHOL и ядра IEDLLF. Последовательность играет ключевую роль в возмущении мембраны. Более короткий α-спиральный фрагмент слитого пептида БВРС-КоВ (RSAIEDLLFDKVT) и гомологичный высококонсервативный фрагмент слитых пептидов SARS-CoV / SARS-CoV-2 (RSFIEDLLFNKVT) [ 52] были выбраны для имитации слияния, ассоциированного с вирусом. Выбранные пептиды в дальнейшем были отнесены к FP-MERS-CoV и FP-SARS-CoV-2 соответственно. FP-SARS-CoV-2 и FP-MERS-CoV добавляли к везикулам POPC / SM / CHOL (60/20/20 мол.%), Чтобы вызвать слияние мембран. Результаты добавления различных концентраций пептидов в водные растворы, купание везикул POPC / SM / CHOL, нагруженных кальцеином, показаны на Рисунке S2c, d ( Дополнительные материалы ). Более того, 50 мкМ FP-SARS-CoV-2 и 200 мкМ FP-MERS-CoV были использованы для индукции слияния липосом для проверки ингибирующего действия алкалоидов.

    

   Чтобы проверить ингибирующее слияние действие алкалоидов, индуктор слияния (кальций или моделирующие слитые пептиды в соответствующих концентрациях) добавляли к липосомам, предварительно инкубированным с 400 мкМ алкалоидов (за исключением 40 мкМ таберсонина). Поскольку таберсонин в концентрации 400 мкМ полностью ингибировал опосредованное кальцием слияние везикул DOPG / CHOL и DOPC / DOPG / CHOL, чтобы понять, зависит ли его ингибирующий эффект от липидного состава липосом, мы снизили его концентрацию на 10 -складывать. Обе концентрации таберсонина (40 и 400 мкМ) использовали для проверки его ингибирующего действия на слияние, опосредованное FP-SARS-CoV-2 и FP-MERS-CoV. Мы обнаружили, что градиент осмотического давления, возникающий в результате добавления индуктора слияния или ингибитора, не влияет на утечку кальцеина из липосом (данные не показаны).

    

   Степень высвобождения кальцеина определяли на спектрофлуориметре «Флюорат-02-Панорама» («Люмекс», Санкт-Петербург, Россия). Длина волны возбуждения составляла 490 нм, а длина волны излучения составляла 520 нм. Тритон X-100 добавляли до конечной концентрации 1% к каждому образцу, чтобы полностью разрушить липосомы, и измеряли интенсивность после высвобождения общего количества кальцеина из липосом. Для описания слияния липосомальных мембран относительную флуоресценцию просочившегося кальцеина ( RF ,%) рассчитывали по следующей формуле:

    

   R F знак равно я-я0яМаксимум/ 0,9 -я0⋅ 100 % ,

    

   (1)где I и I 0 представляли собой интенсивности флуоресценции кальцеина в образце в присутствии и в отсутствие индуктора / ингибитора слияния, соответственно, а I max представляла собой максимальную флуоресценцию образца после лизиса липосом Triton X-100. Коэффициент 0,9 был введен для расчета разбавления образца Тритоном Х-100.

    

   Индекс ингибирования ( II ) был рассчитан для характеристики относительной эффективности тестируемых алкалоидов в ингибировании слияния липосом по сравнению с действием одного индуктора слияния на тот же липосомный препарат:

    

   яязнак равно рFU - RFSрFU⋅ 100 % ,

    

   (2)где RF U и RF S были максимальной относительной флуоресценцией просочившегося кальцеина при слиянии везикул, индуцированном кальцием или моделирующими слитыми пептидами в отсутствие ( RF U , U = Ca 2+ / FP-MERS-CoV / FP-SARS- CoV-2 ) и наличие алкалоидов ( RF S ) соответственно. Оценка RF S была сделана с учетом внутреннего эффекта алкалоидов (утечка кальцеина из-за сильного разупорядочивающего действия липидов одного алкалоида, RF A ). Рисунок S3 и таблица S1 (Дополнительные материалы ) представляют кинетику и максимальные значения RF A при добавлении различных алкалоидов в водные растворы, купание DOPG / CHOL, нагруженного кальцеином (80/20 мол.%) ( Рисунок S3a ), DOPC / DOPG / CHOL (40/40). / 20 мол.%) ( Рисунок S3b ) и везикулы POPC / SM / CHOL (60/20/20 мол.%) ( Рисунок S3c ). Временные зависимости утечки кальцеина были аппроксимированы двухэкспоненциальными функциями с характерными временами t 1 и t 2 , связанными с быстрым и медленным компонентами процесса высвобождения.

    

   2.3. Конфокальная флуоресцентная микроскопия

    

   Визуализацию изменений морфологических особенностей и поведения везикул в суспензии под действием индукторов слияния проводили путем маркировки липосомных мембран флуоресцентно меченным липидом Rh-DPPE. Гигантские однослойные везикулы получали из смеси POPC / SM / CHOL (60/20/20 мол.%) И 1 мол.% Флуоресцентного липидного зонда Rh-DPPE методом гальванопластики (стандартный протокол, 3 В, 10 Гц, 1 ч. , 25 ° C) с использованием Nanion Vesicle Prep Pro (Мюнхен, Германия). Полученная суспензия липосом содержала 1 мМ липида в 0,5 М растворе сорбита. Были добавлены измерения слияния липосом; 10% PEG-8000, 50 мкМ FP-SARS-CoV-2 и 200 мкМ MERS-CoV использовали для индукции слияния мембран и инкубировали в течение 1-2 мин при комнатной температуре (25 ± 1 ° C). Везикулы получали через масляный иммерсионный объектив (65 × / л. 4HCX PL) с помощью Olympus (Гамбург, Германия). Для возбуждения Rh-DPPE использовался гелий-неоновый лазер с длиной волны 561 нм. Температура во время наблюдения контролировалась нагревом / охлаждением воздуха в теплоизолированной камере.

    

   2.4. Динамическое рассеяние света

    

   Небольшие однослойные везикулы, состоящие из DOPG / CHOL (80/20 мол.%) И POPC / SM / CHOL (60/20/20 мол.%), Получали путем экструзии и обрабатывали 400 мкМ котинина, мелатонина, 3-изобутил- 1-метилксантин, люпинин, пиперин, горденин и 40 или 400 мкМ таберсонина в течение 30 минут перед добавлением 20 мМ CaCl 2 , 50 мкМ FP-SARS-CoV-2 и 200 мкМ раствора MERS-CoV. Использовали три различных контрольных образца: немодифицированные липосомы и везикулы, инкубированные с индуктором слияния, и только с ингибитором. Мы обнаружили, что добавление одного алкалоида в суспензию липосом не привело к заметному изменению размера везикул (данные не показаны). Гидродинамический диаметр ( d, нм) и дзета-потенциал (ζ, мВ) определяли на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments Ltd., Малверн, Великобритания) постепенным титрованием суспензии липосом в PBS при 25 ° C.

    

   2.5. Измерение граничного потенциала мембраны

    

   Практически не содержащие растворителей плоские липидные бислои были приготовлены с использованием метода противодействия монослою [ 53 ] на апертуре диаметром 50 мкм в тефлоновой пленке толщиной 10 мкм, разделяющей два отсека тефлоновой камеры. Установившаяся проводимость K +-нонактин модулировался посредством двустороннего добавления колхицина, котинина, 1,7-диметилксантина, капсаицина, синефрина, 3-изобутил-1-метилксантина, люпинина, пиперина, таберсонина и горденина из различных исходных растворов мМ в этаноле или метанола в раствор для смывания мембран (0,1 М KCl, pH 7,4), чтобы получить конечную концентрацию в диапазоне от 5 мкМ до 1 мМ. Отверстие предварительно обрабатывали гексадеканом. Липидные бислои были сделаны из ДОПГ / ХОЛ (80/20 мол.%). Проводимость липидных бислоев определяли путем измерения проводимости мембраны ( G ) при постоянном трансмембранном напряжении ( V = 50 мВ). В последующих расчетах предполагалось, что проводимость мембраны связана с граничным потенциалом мембраны ( φ b), перепад потенциала между водным раствором и гидрофобным ядром мембраны по распределению Больцмана [ 54 ]:

    

   G ~ ξ⋅ Cехр ( -zеϕбk T)

    

   (3)где ξ - подвижность ионов, ze - заряд иона, k - постоянная Больцмана, а T - абсолютная температура.

    

   Ag / AgCl электроды с 1,5% агарозном / 2 М KCl мосты были использованы для применения V и измерить G .

    

   Ток измеряли с помощью усилителя Axopatch 200B (Molecular Devices, LLC, Orleans Drive, Саннивейл, Калифорния, США) в режиме фиксации напряжения. Данные были оцифрованы с использованием Digidata 1440A и проанализированы с использованием pClamp 10.0 (Molecular Devices, LLC, Orleans Drive, Sunnyvale, CA, USA) и Origin 8.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). Данные были получены с частотой дискретизации 5 кГц с использованием фильтрации нижних частот на 200 Гц.

    

   Все эксперименты проводились при комнатной температуре (25 ° C).

    

   2.6. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия

    

   Эксперименты по дифференциальной сканирующей микрокалориметрии выполняли с помощью μDSC 7EVO (Setaram, Caluire-et-Cuire, Франция). Гигантские однослойные везикулы получали из смеси DPPG / CHOL (90/10 мол.%) Методом гальванопластики (стандартный протокол, 3 В, 10 Гц, 1 час, 55 ° C). Суспензия липосом содержала 3 мМ липида и была забуферена 5 мМ HEPES при pH 7,4. Исследуемые алкалоиды (колхицин, котинин, 1,7-диметилксантин, капсаицин, синефрин, 3-изобутил-1-метилксантин, люпинин, пиперин и горденин) добавляли к аликвотам для получения конечной концентрации алкалоидов до 400 мкМ (кроме для 40 мкМ таберсонина). Суспензию липосом нагревали с постоянной скоростью 0,2 ° С · мин -1.. Обратимость тепловых переходов оценивалась повторным нагревом образца сразу после этапа охлаждения из предыдущего сканирования. Температурную зависимость избыточной теплоемкости анализировали с помощью Calisto Processing (Setaram, Caluire-et-Cuire, Франция). Пики на термограммах характеризовались максимальными температурами основного фазового перехода ( T m ) смеси DPPG / CHOL и полушириной основного пика ( T 1/2 ), указывающим размер кооперативной липидной единицы.

    

   2.7. Оценка противовирусной активности in vitro

    

   Для анализа противовирусной активности пиперина эпителиальные клетки почек обезьяны Vero (ATCC CCL81) выращивали в культуральных флаконах (Nunc, Роскилле, Дания) в культуральной среде DMEM с добавлением 10% FBS. Концентрацию клеток доводили до 5 × 10 5 клеток / мл, и клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты (0,1 мл на лунку). Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 . Пиперин растворяли в ДМСО, а затем готовили двукратные серийные разведения от 200 до 1,56 мкг / мл в бессывороточной питательной среде DMEM / F12. После этого к клеткам Vero добавляли 100 мкл / лунку каждого разведения пиперина и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C в 5% CO 2.Атмосфера. В контрольные лунки вместо пиперина добавляли бессывороточную среду DMEM / F12. Аликвоты SARS-CoV-2 (10 3 TCID50 / мл) (изолят 17612) смешивали 1: 1 с разведениями пиперина и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. После 1 ч инкубации пиперин удаляли из планшетов, добавляли 100 мкл / лунку смеси SARS-CoV2 / пиперин в соответствующие лунки и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C в 5% CO 2.атмосферы, вирусосодержащую среду добавляли в лунки вирусного контроля, а бессывороточную среду DMEM / F12 добавляли к клеточному контролю. Затем вирус удаляли, клетки трижды промывали DPBS, в лунки добавляли 100 мкл / лунку разведений пиперина (200–1,56 мкг / мл), в контрольные лунки добавляли бессывороточную среду DMEM / F12. , и планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 . Через 24 часа супернатанты из экспериментальных и контрольных лунок с вирусом собирали и титровали с помощью анализа TCID 50 в клетках Vero после инкубации в течение 72 часов. Визуальную оценку цитопатогенного эффекта (ЦПЭ) вируса проводили с использованием светового инвертированного микроскопа Olympus CKX41 (Olympus, Токио, Япония).

    

   2.8. Статистический анализ

    

   Контрольные RF Ca2 + -, RF FP-MERS-CoV -, RF FP-SARS-CoV-2 -, t 1 - и t 2 - значения , характеризующие слияние везикул, индуцированное CaCl 2 , FP-SARS-CoV-2 или FP-MERS-CoV в отсутствие алкалоидов усредняли от 5 до 9 независимых экспериментов. Экспериментальные RF S -, t 1 - и t -, t 1 - и t 2 -значения были представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего ( p 2 -значения, характеризующие CaCl 2 -, FP-SARS-CoV-2- и FP-MERS-CoV-опосредованное слияние липосом, предварительно обработанных различными алкалоидами, были усреднены из 2 до 4 независимых экспериментов. Все РФ ≤ 0,05). Величины d, ζ , T m , T 1/2 и Δ φ b были усреднены от 3 до 5 независимых экспериментов и представлены как среднее ± стандартное отклонение ( p ≤ 0,05).

    

   Для доказательства статистической значимости разницы между значениями RF -, t 1 -, t 2 -, d -, ζ -, T m - и T 1/2 при добавлении алкалоидов и контрольных значений связанных параметров (в отсутствие алкалоидов) использовали непараметрический знаковый U-критерий (U-критерий Манна – Уитни – Уилкоксона) (* - p ≤ 0,01, ** - p ≤ 0,05).

    

   Коэффициент корреляции Пирсона применяли для оценки сильной взаимосвязи между ингибирующим действием алкалоидов на слияние везикул и вызванными алкалоидами изменениями физических свойств липидных бислоев (Δ T m , Δ T 1/2 , Δ φ b ). Коэффициенты рассчитывались с помощью Microsoft Excel (Microsoft Corp., Редмонд, Вашингтон, США).

    

    

3. Результаты и их обсуждение

     3.1. Влияние алкалоидов на опосредованное CaCl 2 слияние отрицательно заряженных липосом

    

   На рисунке S4a –c ( дополнительные материалы ) показана утечка кальцеина в результате 20 мМ CaCl 2 -опосредованного слияния липосом DOPG / CHOL в отсутствие и в присутствии различных алкалоидов при концентрации 400 мкМ (40 мкМ таберсонина). Некоторые алкалоиды были способны ингибировать опосредованное кальцием слияние, и эта способность строго зависела от типа алкалоида ( рис. S4b, c ). В таблице 1 приведены средние значения максимальной утечки маркеров, вызванной индуцированным кальцием слиянием везикул DOPG / CHOL, предварительно обработанных различными алкалоидами ( RF S ). Средняя максимальная утечка при добавлении одного индуктора плавления составляет около 90%. Значительное и надежное снижение RF S (указывающий на ингибирование опосредованного кальцием слияния) вызван предварительной обработкой везикул DOPG / CHOL дигидрокапсаицином ( РФ Ссоставляет около 70%), капсаицин, синефрин ( RF S составляет около 50%), 3-изобутил-1-метилксантин, хинин, пиперин ( RF S составляет около 30%), таберсонин, горденин ( RF S составляет около 20%), и люпинин ( RF S составляет около 10%). Таблица 1. Параметры, характеризующие влияние алкалоидов на высвобождение кальцеина, вызванное опосредованным кальцием слиянием липосом, состоящих из DOPG / CHOL (80/20 мол.%) И DOPC / DOPG / CHOL (40/40/20 мол.%). .

    

   Стол

    

   Таблица 1 также демонстрирует кинетические параметры слияния липосом в присутствии алкалоидов. Следует отметить, что временные зависимости высвобождения маркера за счет слияния везикул хорошо описываются двухэкспоненциальными зависимостями с характерными временами, связанными с быстрым и медленным компонентами ( t 1 и t 2 соответственно). Анализ таблицы 1 показывает, что t 1 и t 2значения варьируются в пределах 1–10 и 10–120 мин соответственно. Быстрый компонент может характеризовать сорбцию кальция на отрицательно заряженных мембранах, обогащенных DOPG, и последующую агрегацию липидных пузырьков, тогда как медленный компонент может быть связан с топологическими перестройками мембранных липидов и дальнейшей утечкой красителя при слиянии липосом. Колхицин, капсаицин и таберсонин значительно ускоряли кинетику высвобождения маркера при опосредованном кальцием слиянии везикул DOPG / CHOL (наблюдается примерно 5-10-кратное уменьшение обоих характерных времен) ( Таблица 1 ). Мелатонин и хинин резко замедляли процесс слияния, увеличивая t 2 примерно с 70 до более чем 100 минут ( таблица 1 ).

    

   Для того, чтобы характеризовать относительную эффективность различных алкалоидов ингибировать кальций-опосредованных липосомы слияния DOPG / ХОЛ индекс ингибирования ( II ) был рассчитан с использованием формулы (2) для одного приготовления суспензии липосом, а затем усредняется между различными препаратами ( рис 1 через ). С учетом значения II исследованные алкалоиды были разделены на три группы: малоэффективные ( II не превышает 15%); низкой и средней эффективности ( II находится в диапазоне 16–50%) и высокого КПД ( IIболее 50%). Первая группа включает 3,9-диметилксантин, кофеин, 7- (β-гидроксиэтил) теофиллин, колхицин, пентоксифиллин, котинин, 1,7-диметилксантин, атропин, теофиллин, мелатонин и берберин. Эффективность во второй группе увеличивается в ряду: дигидрокапсаицин ( II около 25%) ≤ капсаицин ≈ синефрин ( II около 45%). Последняя (наиболее эффективная) группа включает 3-изобутил-1-метилксантин ( II около 65%), пиперин ≈ хинин ( II около 70%), таберсонин ( II около 75%), горденин ( II около 80 %). %) и люпинин ( II около 85%).

    

   Биомедицины 09 01434 g001 550Рисунок 1. Индекс ингибирования ( II ) , характеризующая способность тестируемых алкалоидов подавлять слияние везикул , изготовленные из DOPG / ХОЛА (80/20 мольных%) ( ) и ДОФЙ / DOPG / ХОЛ (40/40/20 мольных% ) ( б ). Липосомы инкубировали с 400 мкМ алкалоидов (за исключением 40 мкМ таберсонина) в течение 30 мин перед добавлением CaCl 2 .

    

   На рисунке 2а показаны результаты измерения размера после добавления кальция в немодифицированные липосомы DOPG / CHOL и везикулы, предварительно обработанные алкалоидами с различной антифузогенной активностью, котинином, мелатонином, 3-изобутил-1-метилксантином, люпинином, пиперином, таберсонином и горденином. . Диаметр липосом ДОПГ / ХОЛ в отсутствие модификаторов составляет 80 ± 20 нм. CaCl 2 вызывает слияние липосом, и размер везикул увеличивается до 145 ± 40 нм ( рис. 2).а). Котинин и мелатонин практически не влияли на эффект увеличения размеров кальция, так как диаметр липосом составлял около 140 нм. Другие протестированные соединения (люпинин, 3-изобутил-1-метилксантин, таберсонин, пиперин и горденин) значительно ингибировали опосредованное кальцием слияние липосом: диаметр везикул был равен 77 ± 13 нм ( рис. 2 а). Полученные данные хорошо согласуются соЗначения II оцениваются с помощью анализа высвобождения кальцеина ( рис. 1 а). Биомедицины 09 01434 g002 550Рис. 2. Диаметр ( d , нм) ( a ) и ζ-потенциал ( b ) липосом DOPG / CHOL (80/20 мол.%) До и после добавления 20 мМ CaCl 2 к немодифицированным везикулам и липосомам, предварительно обработанным 400 мкМ котинина, мелатонина, 3-изобутил-1-метилксантина, лупинина, пиперина, горденина или 40 мкМ таберсонина. * - p ≤ 0,01, ** - p ≤ 0,05 (тест Манна – Уитни – Вилкоксона, необработанные липосомы против везикул в присутствии CaCl 2 и / или алкалоидов).

    

   На рисунке 2b представлены результаты оценки ζ-потенциала липосом DOPG / CHOL в присутствии 20 мМ CaCl 2 без и с различными алкалоидами. Ζ-потенциал немодифицированных липосом DOPG / CHOL был равен примерно -70 мВ. Добавление кальция привело к увеличению ζ-потенциала примерно до -50 мВ. Значение ζ-потенциала везикул ДОПГ / ХОЛ, предварительно обработанных алкалоидами, было на 10–20 мВ меньше, чем у необработанных ( рис. 2b). Наблюдаемая неполная компенсация отрицательного поверхностного заряда липосом, обогащенных ДОПГ, ожидалась при введении положительно заряженных ионов кальция и молекул алкалоидов (люпинина, таберсонина и горденина). Несогласие со способностями алкалоидов ингибировать опосредованное кальцием слияние пузырьков и увеличивать ζ-потенциал (Рисунок 2 а, б) ясно демонстрирует, что антифузогенная активность алкалоидов не связана с частичной компенсацией отрицательного поверхностного заряда мембраны алкалоидами или конкуренцией между алкалоидами и ионами кальция за взаимодействие с отрицательно заряженными липидными группами.

    

   Для изучения зависимости ингибирующего действия алкалоидов от липидного состава сливающихся везикул в состав мембран был введен ДОФХ. Следует отметить, что клеточные мембраны обогащены видами фосфатидилхолина по сравнению с вирионами . Уменьшение доли отрицательно заряженного ДОПГ в составе мембраны с 80 до 40 мол.% Сопровождалось увеличением концентрации CaCl 2 с 20 до 40 мМ до достижения значения RF S около 80%. Рисунок S4d –f ( Дополнительные материалы ) демонстрирует утечку кальцеина, вызванную кальцием-опосредованным слиянием липосом DOPC / DOPG / CHOL. РФ Св результате кальций-опосредованного слияния везикул ДОФХ / ДОПГ / ХОЛ, предварительно обработанных различными алкалоидами, достоверно уменьшается в ряду: кофеин ≈ пентоксифиллин ≈ котинин ≈ хинин ( RF S составляет около 65%) ≥ атропин ≈ дигидрокапсаицин ≈ капсаицин ( RF S составляет около 55 %)> люпинин ( RF S составляет около 40%)> пиперин ( RF S составляет около 25%)> таберсонин ( RF S равен 1%).

    

   Кинетические параметры временной зависимости утечки кальцеина, вызванной кальцием-опосредованным слиянием липосом DOPC / DOPG / CHOL, показаны в таблице 1 . Колхицин и капсаицин ускоряют кинетику высвобождения из-за опосредованного кальцием слияния везикул DOPC / DOPG / CHOL, а также липосом DOPG / CHOL. Огромное ингибирование опосредованного кальцием слияния липосом DOPC / DOPG / CHOL в присутствии таберсонина не позволило определить характерные времена кинетики высвобождения красителя. Подобно везикулам DOPG / Chol, предварительная обработка липосом DOPC / DOPG / CHOL колхицином и капсаицином приводила примерно к пятикратному снижению t 2.-ценить. В отличие от случая везикул DOPG / CHOL, кинетика утечки кальцеина из-за слияния липосом DOPC / DOPG / CHOL также была ускорена пиперином (в шесть раз), в то время как теофиллин и атропин немного замедляли процесс слияния, увеличивая t 2 от От 50 до примерно 100 и 120 минут, соответственно.

    

   На рисунке 1b показаны значения II , характеризующие относительную способность различных алкалоидов подавлять слияние везикул DOPC / DOPG / CHOL. Кроме того, 3,9-диметилксантин, 7- (β-гидроксиэтил) теофиллин, колхицин, 1,7-диметилксантин, теофиллин, мелатонин, берберин, синефрин, 3-изобутил-1-метилксантин и горденин не продемонстрировали значительной способности к ингибируют слияние липосом DOPC / DOPG / CHOL. Кофеин, пентоксифиллин, котинин, атропин, дигидрокапсаицин, капсаицин и хинин характеризовались низкой или средней эффективностью в подавлении слияния везикул, состоящих из смеси тройных липидов, тогда как значения II в присутствии люпинина, пиперина и таберсонина составляли около 50. , 70 и 100% . СравнениеРисунок 1 а, б наглядно демонстрирует, что антифузогенная активность алкалоидов строго зависит от липидного состава везикул.

    

   3.2. Влияние алкалоидов на физические свойства модельной липидной мембраны.

    

   Неоднократно было показано, что эластические характеристики липидного бислоя играют огромную роль в слиянии мембран. Упорядочение липидных головных групп и ацильных цепей, профиль латерального давления в межслоевом слое, фазовое состояние липидов, спонтанная кривизна мембраны, площадь на молекулу липида и другие характеристики могут влиять на слияние . Многие из этих параметров влияют друг на друга, но все они напрямую зависят от липидного состава мембраны. Ключевая роль липидов также подтверждается тем фактом, что вирусные инфекции могут изменять синтез липидов в клетках, регулируя его в соответствии со своими потребностями . Способность алкалоидов и их производных изменять физические свойства бислоя при интеркаляции была продемонстрирована в ряде исследований . В частности, алкалоиды влияют на упаковку липидов , изменяют температуру фазовых переходов липидов  и т. Д. Недавно мы провели детальное исследование влияния алкалоидов на физические свойства мембраны POPC. Чтобы понять взаимосвязь между эффектами алкалоидов на слияние и модуляцию липидной матрицы под их действием, было выполнено влияние тестируемых алкалоидов на свойства PG и CHOL-обогащенных бислоев. На рис. 3 представлены типичные термограммы нагрева DPPG / CHOL-липосом в отсутствие (контроль) и в присутствии тестируемых алкалоидов. Значение температуры фазового перехода ( T m ) смеси DPPG / CHOL и полуширина основного пика ( T 1/2 ) приведены в таблице 2 . T m - это точка, в которой происходит термически индуцированное плавление липидов [ 68 ], а T 1/2 описывает резкость фазового перехода или обратную кооперативность этого процесса [ 69 ]. Температура основного перехода ( Т м) необработанных везикул DPPG / CHOL равна 40,4 ° C, с полушириной пика ( T 1/2 ) около 0,8 ° C ( рис. 3 , контроль).

    

   Биомедицины 09 01434 g003 550Рисунок 3. Термограммы нагревания липосом DPPG / CHOL (90/10 мол.%) В отсутствие и в присутствии 400 мкМ 1,7-диметилксантина, пиперина, горденина, котинина, 3-изобутил-1-метилксантина, люпинина, синефрина, капсаицин, колхицин и 40 мкМ таберсонина. Таблица 2. Параметры, характеризующие влияние алкалоидов на физические свойства липидных бислоев: T m - основная температура перехода DPPG / CHOL (90/10 мол.%); T 1/2 - полуширина основного пика в присутствии 400 мкМ алкалоидов (40 мкМ таберсонина); Δ φ b (max) - максимальные изменения граничного потенциала мембран ДОПГ / ХОЛ (80/20 мол.%).

    

   Стол

    

   Колхицин, котинин и 1,7-диметилксантин не влияли на термотропное фазовое поведение смеси DPPG / CHOL ( рисунок 3 , таблица 2 ). Синефрин, 3-изобутил-1-метилксантин, люпинин и горденин снижали T m примерно на 0,3–0,7 ° C и увеличивали T 1/2 на 0,4–0,6 ° C ( рисунок 3 , таблица 2 ). Эти данные согласуются с результатами исследования влияния горденина на фазовое поведение димиристоилфосфатидилглицерина [ 61 ]. Введение капсаицина, пиперина и таберсонина сопровождалось резким снижением T m (0,9–2,1 ° C) и увеличением T 1/2.(0,7–1,2 ° C) ( рисунок 3 , таблица 2 ). Коэффициенты корреляции между Log D o / w ( Таблица S1, дополнительные материалы ) и значениями –Δ T m - и Δ T 1/2 ( Таблица 2 ) находятся в диапазоне 0,74–0,77, демонстрируя хорошую корреляцию между липофильностью молекулы алкалоидов и их способность изменять упаковку липидов. Коэффициент корреляции между вызванными алкалоидами изменениями T m DPPG / CHOL ( таблица 2 ) и их значениями II в везикулах DOPG / CHOL ( рисунок 1 а) был равен 0,52, соответствующий коэффициент, характеризующий взаимозависимость изменений, вызванных алкалоидами. в T 1/2 ( таблица 2 ) и II значениях ( таблица 1 ) равнялась 0,63. Коэффициент корреляции между вызванными алкалоидами изменениями T m ( таблица 2 ) и их значениями II в везикулах DOPC / DOPG / CHOL ( таблица 1) был равен 0,64, в то время как взаимозависимость индуцированных соединением изменений в значениях T 1/2 ( таблица 2 ) и алкалоида II липосом DOPC / DOPG / CHOL ( рисунок 1б) характеризовался коэффициентом 0,68. Наблюдаемая корреляция между параметрами, характеризующими плавление липидов, особенно кооперативность липидного фазового перехода, и индексом ингибирования слияния указывает на взаимосвязь между способностью алкалоидов нарушать мембранные липиды и ингибировать слияние липосом. Включение алкалоидов в полярную область мембраны, приводящее к увеличению бокового давления, положительного напряжения кривизны и площади, приходящейся на одну молекулу липида в этой области, способствует как снижению температуры / кооперативности фазового перехода, так и увеличение энергии интермедиатов слияния, характеризующихся липидными поверхностями отрицательной кривизны. Причем сравнение полученных данных ( Рисунок 3 , Таблица 2) и наши недавно опубликованные результаты  демонстрируют, что испытанные алкалоиды по-разному влияют на фазовое поведение DPPG / CHOL и DPPC. Этот факт может быть связан с наблюдаемой разницей в их способности ингибировать слияние везикул DOPG / CHOL и DOPC / DOPG / CHOL ( Рисунок 1 , Таблица 1). Напряжение кривизны, вызванное алкалоидами, должно зависеть от глубины внедрения молекулы в липидный бислой и ее ориентации в мембране. Значительное ингибирующее действие 3-изобутил-1-метилксантина на слияние липосом DOPG / CHOL может быть связано с индукцией высокого напряжения положительной кривизны из-за как электростатического взаимодействия между остатком ксантина и DOPG на поверхности мембраны, так и тенденции изобутильной боковой цепи, которая должна быть встроена в углеводородное ядро ​​мембраны. Производные ксантина с более низкой гидрофобностью, например кофеин, пентоксифиллин, 1,7-диметилксантин, 3,9-диметилксантин и 7- (β-гидроксиэтил) теофиллин ( Таблица S1 , Дополнительные материалы) не ингибирует опосредованное кальцием слияние липосом DOPG / CHOL. Введение ДОФХ в липидный состав мембран сопровождалось двукратным снижением содержания ДОПГ, что приводило к значительным изменениям ориентации мембран и встраиванию ксантинов. Таким образом, кофеин и пентоксифиллин продемонстрировали слабый ингибирующий эффект на слияние везикул DOPC / DOPG / CHOL, в то время как 3-изобутил-1-метилксантин не влиял на этот процесс. Аналогичным образом можно объяснить полную потерю ингибирующей способности производных β-фенилэтиламина, синефрина и горденина в мембранах с более низким содержанием ДОПГ по сравнению с обогащенными ДОПГ бислоями.

    

   Учитывая, что слияние липосом запускается ионами кальция, мы также рассмотрели возможность влияния алкалоидов на слияние, изменяя граничный потенциал мембран. В таблице 2 приведены максимальные изменения φ b при адсорбции различных алкалоидов (–Δ φ b (max)). Зависимости Δ φ b от концентраций исследуемых алкалоидов представлены на Рисунке S5 ( Дополнительные материалы ). Таберсонин значительно увеличил φ b мембран DOPG / CHOL (примерно на 60 мВ), в то время как капсаицин резко снизил это значение (примерно на -70 мВ) ( Рисунок S5 вДополнительные материалы , таблица 2 ). Колхицин, синефрин, 3-изобутил-1-метилксантин, люпинин и пиперин привели к снижению φ b примерно на 20-40 мВ ( рисунок S5 в дополнительных материалах , таблица 2 ). Котинин, 1,7-диметилксантин и горденин практически не изменили значение φ b ( рисунок S5, дополнительные материалы , таблица 2 ). Корреляции между Δ φ b мембран ДОПГ / ХОЛ после добавления алкалоидов и их IIценности. Этот факт демонстрирует незначительную роль изменения электрических свойств бислоя алкалоидами в их способности ингибировать опосредованное кальцием слияние мембран.

    

   3.3. Слияние липосом, опосредованное фрагментами пептидов слияния

    

   Пандемия COVID-19 создала серьезные проблемы для систем здравоохранения во всем мире. Отсутствие специфического лечения, вирусные мутации, появление новых штаммов, которые стали устойчивыми к вакцинам, и многие другие факторы привели к поиску новых лекарств для лечения COVID-19. Чтобы продемонстрировать фармакологическое применение алкалоидов в качестве ингибиторов слияния коронавирусов, были изучены способности наиболее эффективных соединений подавлять слияние мембран, вызванное FP-MERS-CoV и FP-SARS-CoV-2. Эти пептиды способны индуцировать высвобождение кальцеина из-за слияния липосом POPC / SM / CHOL ( рисунок S2c, d Дополнительные материалы ) и неэффективны для получения слияния везикул DOPG / CHOL (данные не показаны).

    

   Для дальнейшей проверки фузогенных свойств FP-MERS-CoV и FP-SARS-CoV-2 была проведена конфокальная флуоресцентная микроскопия гигантских однослойных везикул, состоящих из POPC / SM / CHOL. На рисунке 4 представлены флуоресцентные микрофотографии липосом POPC / SM / CHOL в отсутствие ( рисунок 4 а) и в присутствии 10% хорошо зарекомендовавшего себя индуктора слияния PEG-8000 ( рисунок 4 b), 50 мкМ FP-SARS-CoV- 2 ( рис. 4 c) и 200 мкМ FP-MERS-CoV ( рис. 4 d). Оба пептида в указанных концентрациях вызывали деформацию и агрегацию липидных везикул и увеличивались в размерах. FP-SARS-CoV-2, в отличие от FP-MERS-CoV, также индуцировал образование многослойных и мультивезикулярных липосом ( Рисунок 4в). В целом морфологическая картина под действием обоих пептидов аналогична той, которая имела место при добавлении PEG-8000 ( рис. 4b). Таким образом, полученные результаты подтверждают фузогенную активность FP-SARS-CoV-2 и FP-MERS-CoV. Биомедицины 09 01434 g004 550Рисунок 4. Флуоресцентные микрофотографии гигантских однослойных везикул, сделанных из POPC / SM / CHOL (60/20/20 мол.%) И 1 мол.% Флуоресцентного липидного зонда Rh-DPPE в отсутствие каких-либо модификаторов ( а ) и в присутствии 10% PEG-8000 ( b ), 50 мкМ FP-SARS-CoV-2 ( c ) и 200 мкМ FP-MERS-CoV ( d ).

    

   На фиг.5a, d представлены эффекты алкалоидов, которые эффективно ингибируют опосредованное кальцием слияние везикул DOPG / CHOL, 3-изобутил-1-метилксантина, пиперина, таберсонина, горденина и люпинина, на утечку кальцеина, вызванную FP-SARS- CoV-2- и FP-MERS-CoV-опосредованное слияние липосом POPC / SM / CHOL соответственно. В отсутствие алкалоидов RF s -значение, продуцируемое 50 мкМ FP-SARS-CoV-2 и 200 мкМ FP-MERS-CoV, составляло около 70 ( Рисунок 5 a) и 80% ( Рисунок 5 d), соответственно. В таблице 3 суммированы средние значения максимальной утечки маркера, вызванной пептидом-индуцированным слиянием везикул POPC / SM / CHOL, предварительно обработанных различными алкалоидами, и кинетические параметры слияния липосом в присутствии алкалоидов.RF S, вызванный FP-SARS-CoV-2-опосредованным слиянием везикул POPC / SM / CHOL, значительно снижался в присутствии пиперина ( RF S составляет около 30%) и таберсонина ( RF S составляет около 50%). Более того, пиперин также был эффективен против слияния, опосредованного FP-MERS-CoV ( RF S составляет около 30%), в то время как таберсонин не характеризовался способностью ингибировать опосредованное FP-MERS-CoV слияние липосом POPC / SM / CHOL. Вызванная синтезом утечка в присутствии 3-изобутил-1-метилксантина, таберсонина, горденина и люпинина характеризовалась более быстрой кинетикой по сравнению с отсутствием алкалоидов, в то время как высокоактивный пиперин немного замедлял кинетику FP-MERS-CoV- индуцированный термоядерный синтез за счет увеличения t2 -значение.

    

   Биомедицины 09 01434 g005 550Рисунок 5. Воздействие алкалоидов на FP-SARS-CoV-2 (верхняя панель) и FP-MERS-CoV (нижняя панель) слияние везикул POPC / SM / CHOL (60/20/20 мол.%). ( a , d ) Временная зависимость относительной флуоресценции кальцеина ( RF S ,%), просочившейся из-за слияния, вызванного 50 мкМ FP-SARS-CoV-2; ( а ) и 200 мкМ FP-MERS-CoV; ( г ) в отсутствие и в присутствии алкалоидов. Липосомы инкубировали с 400 мкМ алкалоидов в течение 30 мин перед добавлением пептидов. Соотношение между цветной линией и алкалоидом показано на рисунке. ( б , д ) Индекс ингибирования ( II) характеризует способность тестируемых алкалоидов подавлять слияние, вызванное 50 мкМ FP-SARS-CoV-2 ( b ); и 200 мкМ FP-MERS-CoV ( e ). ( c , f ) Диаметр ( d , нм) липосом POPC / SM / CHOL до и после добавления 50 мкМ FP-SARS-CoV-2 ( c ) и 200 мкМ FP-MERS-CoV ( f ) в везикулы, предварительно обработанные 400 мкМ пиперина или таберсонина. * - p ≤ 0,01 (тест Манна – Уитни – Вилкоксона, необработанные липосомы против везикул в присутствии гибридных пептидов и / или алкалоидов).

    

   Таблица 3. Параметры, характеризующие влияние алкалоидов на высвобождение кальцеина, вызванное FP-SARS-CoV-2 и FP-MERS-CoV-опосредованным слиянием липосом, состоящих из POPC / SM / CHOL.

    

   Стол

    

   На фиг.5b, e показаны значения алкалоида II, ясно демонстрирующие способность пиперина значительно ингибировать как FP-SARS-CoV-2-, так и FP-MERS-CoV-опосредованное слияние липосом POPC / SM / CHOL, а также селективность Таберсонин антифузогенное действие. Наблюдаемая избирательность действия таберсонина против слияния липосом, вызванного FP-SARS-CoV-2 и FP-MERS-CoV, требует дальнейшего изучения. Чтобы дополнительно продемонстрировать антифузогенную активность пиперина, размер везикул до и после добавления FP-SARS-CoV-2 и FP-MERS-CoV к немодифицированным и предварительно обработанным алкалоидами липосомам POPC / SM / CHOL измеряли динамическим методом. светорассеяние ( рис. 5 в, е). В отсутствие модификаторов диаметры POPC / SM / CHOL-везикул были равны 110 ± 15 нм. Добавление пептида FP-SARS-CoV-2 и FP-MERS-CoV привело к увеличению размера до 290 ± 40 нм и 190 ± 15 нм, соответственно ( рис. 5 c, f). В присутствии пиперина моделирующие слитые пептиды не могли увеличивать диаметр POPC / SM / CHOL-липосом из-за сильного ингибирования слияния везикул алкалоидом. Рисунок 5.c также демонстрирует способность таберсонина предотвращать увеличение размера липосом под действием FP-SARS-CoV-2. Неизменность ζ-потенциала липосом при добавлении FP-SARS-CoV-2- и FP-MERS-CoV как к немодифицированным, так и к предварительно обработанным алкалоидами липосомам POPC / SM / CHOL показана на рисунке S6 ( дополнительные материалы ).

    

   3.4. Оценка противовирусных препаратов

    

   Пиперин - это алкалоид, содержащийся в черном перце, одной из наиболее широко используемых специй. Противовирусная активность алкалоида in vitro и in vivo против MERS-CoV в клетках Vero и на модели мышей уже была продемонстрирована . Здесь мы оценили противовирусную активность пиперина in vitro против вируса SARS-CoV-2.

    

   По результатам анализа цитотоксичности, проведенного Hegeto et al. , значение IC 50 пиперина по отношению к клеткам Vero было равно 183,33 мкг / мл. На основании этого открытия была выбрана максимальная концентрация пиперина 200 мкг / мл. Инкубация с 200 мкг / мл пиперина в течение 72 ч привела к гибели всех клеток в лунках; все использованные более низкие концентрации пиперина были нетоксичны для клеток Vero (данные не показаны).

    

   Для определения инфекционной активности вирусного потомства готовили десятикратные разведения супернатантов, собранных из экспериментальных лунок, и вирусных контролей в бессывороточной среде DMEM / F12. Полученные разведения добавляли в 96-луночный культуральный планшет с 80–90% монослоем клеток Vero и инкубировали в течение 72 часов. После этого была проведена визуальная оценка цитопатогенного эффекта (ЦПД) вируса. В контрольных образцах без добавок титр вируса составлял 10 4 TCID 50 / мл. Образцы с концентрацией пиперина 1,56 мкг / мл дали 10 3 TCID 50 / мл; концентрации алкалоидов 3,12–25 мкг / мл имели 10 2 TCID 50/ мл, а в образцах с пиперином концентрации ЦПЭ 50 и 100 мкг / мл вообще не наблюдались. Таким образом, было четко продемонстрировано значительное снижение титра потомства SARS-CoV2 в клетках Vero при 1,56–100 мкг / мл пиперина.

    

4. Выводы

     Новые противовирусные препараты широкого спектра действия необходимы в связи с увеличением числа вирусных инфекций. Ингибиторы слияния вирусов могут быть эффективными противовирусными агентами, поскольку слияние является необходимым этапом жизненного цикла вируса. Мы использовали вторичные метаболиты растений, в частности алкалоиды, как новый класс ингибиторов слияния. Было показано, что способность алкалоидов ингибировать опосредованное кальцием слияние липосом зависит от их липидного состава. Обнаружена корреляция между антифузогенной активностью алкалоидов и их разупорядочивающим действием на липиды мембран. Кроме того, была продемонстрирована способность пиперина подавлять слияние, вызванное фрагментами слитых пептидов коронавируса (MERS-CoV и SARS-CoV / SARS-CoV-2). Мы также показали, что пиперин резко снижает титр потомства SARS-CoV2 in vitro вКлетки Vero при использовании в нетоксичных концентрациях. Таким образом, мы предполагаем, что противовирусная активность пиперина связана с его липид-ассоциированным действием. Более того, насколько нам известно, за исключением одного биоанализа с псевдотипными частицами SARS-CoV-2-S , это первое исследование, демонстрирующее in vitro активность пиперина против вируса SARS-CoV-2. Следует отметить, что пиперин с куркумином изучается в нескольких клинических испытаниях для лечения COVID-19 . Согласно , прием перорального куркумина с пиперином существенно снизил заболеваемость и смертность от COVID-19. Мы надеемся, что со временем количество эффективных алкалоидов в лечении COVID-19 увеличится. Использование растительных метаболитов может успешно дополнить существующие терапевтические стратегии, что позволит более эффективно бороться с вирусом SARS-CoV-2. Дополнительные материалы

    

   Рисунок S1: Химические структуры протестированных алкалоидов, Рисунок S2: Временная зависимость относительной флуоресценции кальцеина, просочившегося из DOPG / ХОЛ (80/20 мол.%) (А), ДОФХ / ДОФГ / ХОЛ (40/40/20 мол.%) (Б) и POPC / SM / ХОЛ (60/20/20 мол.%) (В, г) везикулы, индуцированные различными концентрациями CaCl 2 (a, b), FP-SARS-CoV-2 (c) и FP-MERS-CoV (d). Соотношение между цветной линией и концентрацией индукторов плавления показано на рисунке; Рисунок S3: Временная зависимость относительной флуоресценции кальцеина ( RF A,%) утечки из ДОПГ / ХОЛ (80/20 мол.%) (а), ДОФХ / ДОПГ / ХОЛ (40/40/20 мол.%) (б) и ПОФХ / SM / ХОЛ (60/20/20 мол. %) (c) везикулы, индуцированные только алкалоидами. Алкалоиды добавляли в липосомальную суспензию до концентрации 400 мкМ (за исключением 40 мкМ таберсонина в везикулах DOPG / CHOL и DOPC / DOPG / CHOL) в начальный момент. Соотношение между цветной линией и компаундом показано на рисунке; Рисунок S4. Временная зависимость относительной флуоресценции кальцеина ( RF S ,%), вытекшего в результате слияния ДОПГ / ХОЛ (80/20 мол.%) (А – в) и ДОФХ / ДОПГ / ХОЛ (40/40/20 мол.%) ( г – е) везикулы, индуцированные 20 мМ CaCl 2 в отсутствие ( черная линия) и наличие алкалоидов. Липосомы инкубировали с 400 мкМ алкалоидов (за исключением 40 мкМ таберсонина) в течение 30 мин перед добавлением CaCl 2 . Соотношение между цветной линией и алкалоидом показано на рисунке; Рисунок S5: Зависимость изменений мембранного пограничного потенциала (Δ φ b ) от концентрации колхицина (*), котинина (▲), 1,7-диметилксантина (), капсаицина (◯), синефрина (◊) , 3-изобутил-1-метилксантин (●), люпинин (□), пиперин (▼), таберсонин ( ♦ ) и горденин (◄). Мембраны состояли из DOPG / CHOL (80/20 мол.%) И были погружены в 0,1 М KCl при pH 7,4. V= 50 мВ, Рисунок S6: ζ-потенциал липосом POPC / SM / CHOL (60/20/20 мол.%) До и после добавления 50 мкМ FP-SARS-CoV-2 или 200 мкМ FP-MERS -CoV к немодифицированным и предварительно обработанным 400 мкМ пипериновых везикул; Таблица S1: Параметры, характеризующие молекулы алкалоидов и их влияние на утечку кальцеина из липосом различного состава.

    

   Вклад авторов

    

   EVS - исследование, анализ, проверка и написание (исходный проект); SSE - исследование, анализ и проверка; NMY - расследование, AAM - расследование, VVZ - расследование, AVS - расследование, анализ и написание (обзор черновика), OSO - концептуализация, администрирование проекта, надзор, анализ и написание (первоначальный черновик, рецензирование и редактирование). Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

    

   Финансирование

    

   Работа выполнена при финансовой поддержке АО «Эвалар».

    

   Конфликт интересов

    

   Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов. использованная литература

    

   Patridge, E .; Gareiss, P .; Кинч, MS; Хойер, Д. Анализ одобренных FDA лекарств: натуральные продукты и их производные. Drug Discov. Сегодня 2016 , 21 , стр. 204–207. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Zhao, J .; Шань, Т .; Mou, Y .; Чжоу, Л. Биоактивные соединения растительного происхождения, продуцируемые эндофитными грибами. Mini Rev. Med. Chem. 2011 , 11 , 159–168. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Mani, JS; Джонсон, JB; Сталь, JC; Брощак Д.А.; Neilsen, PM; Уолш, КБ; Найкер, М. Натуральные фитохимические вещества, полученные из продуктов, как потенциальные агенты против коронавирусов: обзор. Virus Res. 2020 , 284 , 197989. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Ngwa, W .; Kumar, R .; Томпсон, Д .; Lyerly, W .; Moore, R .; Reid, TE; Lowe, H .; Тоян, Н. Потенциал фитопрепаратов на основе флавоноидов против COVID-19. Molecules 2020 , 25 , 2707. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Кишимото, S .; Сато, М .; Tsunematsu, Y .; Ватанабе, К. Оценка биосинтетического пути и инженерного биосинтеза алкалоидов. Molecules 2016 , 21 , 1078. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Xu, W .; Чжан, М .; Liu, H .; Wei, K .; Он, М .; Li, X .; Hu, D .; Ян, С .; Чжэн Ю. Противовирусная активность алкалоидов аконита из Aconitum carmichaelii Debx. Nat. Ррод. Res. 2019 , 33 , 1486–1490. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Cushnie, TP; Cushnie, B .; Lamb, AJ Alkaloids: Обзор их антибактериальной, антибиотико-усиливающей и антивирулентной активности. Int. J. Antimicrob. Агенты 2014 , 44 , 377–386. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Хан, H .; Мубарак, МС; Амин, С. Противогрибковый потенциал алкалоидов в качестве новой терапевтической мишени. Curr. Drug Targets 2017 , 18 , 1825–1835. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Бойд, MR; Hallock, YF; Карделлина, Дж. Х., 2-й; Манфреди, КП; Блант, JW; McMahon, JB; Buckheit, RW, Jr .; Bringmann, G .; Schäffer, M .; Крэгг, Г. М. Анти-ВИЧ микелламины из Ancistrocladus korupensis . J. Med. Chem. 1994 , 37 , 1740–1745. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Houghton, PJ; Woldemariam, TZ; Хан, AI; Burke, A .; Махмуд, Н. Противовирусная активность природных и полусинтетических хромоновых алкалоидов. Антивирь. Res. 1994 , 25 , 235–244. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Бодивала, HS; Sabde, S .; Mitra, D .; Бутани, KK; Сингх, И. П. Синтез 9-замещенных производных берберина в качестве агентов против ВИЧ. Евро. J. Med. Chem. 2011 , 46 , 1045–1049. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Wan, Z .; Lu, Y .; Liao, Q .; Wu, Y .; Чен, X. Фангчинолин подавляет репликацию вируса иммунодефицита человека типа 1, препятствуя протеолитическому процессингу gp160. PLoS ONE 2012 , 7 , e39225. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Varghese, FS; Kaukinen, P .; Gläsker, S .; Беспалов, М .; Hanski, L .; Веннерберг, К .; Kümmerer, BM; Ахола, Т. Открытие берберина, абамектина и ивермектина в качестве противовирусных средств против чикунгуньи и других альфавирусов. Антивирь. Res. 2016 , 126 , 117–124. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Лю, X .; Wang, Y .; Чжан, М .; Li, G .; Cen, Y. Исследование ингибирующего действия цефарантина на вирус простого герпеса типа 1 (HSV-1) in vitro. Чжун Яо Цай 2004 , 27 , 107–110. [ Google Scholar ] [ PubMed ]

    

   Подбородок, LW; Cheng, YW; Лин, СС; Лай, ГГ; Lin, LY; Чоу, МОЙ; Чжоу, MC; Ян, С.К. Эффекты берберина из ризомы Coptidis, основного компонента китайской фитотерапии, Ching-Wei-San, против вируса простого герпеса. Arch. Virol. 2010 , 155 , 1933–1941. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] Liou, JT; Чен, З.Ы .; Хо, ЖЖ; Ян, ИП; Чанг, DM; Лян, СС; Лай, Дж. Х. Дифференциальные эффекты триптолида и тетрандрина на активацию COX-2, NF-kappaB и AP-1 и продукцию вируса в клетках легких человека, инфицированных вирусом денге. Евро. J. Pharmacol. 2008 , 589 , 288–298. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Hung, TC; Jassey, A .; Лю, Швейцария; Lin, CJ; Lin, CC; Вонг, SH; Ван, JY; Иены, MH; Lin, LT Берберин подавляет проникновение вируса гепатита C, воздействуя на вирусный гликопротеин E2. Фитомедицина 2019 , 53 , 62–69. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Gao, Y .; Tai, W .; Wang, N .; Li, X .; Jiang, S .; Дебнат, AK; Du, L .; Чен, С. Определение новых натуральных продуктов как эффективных ингибиторов вируса Зика широкого спектра действия. Вирусы 2019 , 11 , 1019. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Warowicka, A .; Nawrot, R .; Godzicka-Józefiak, A. Противовирусная активность берберина. Arch. Virol. 2020 , 165 , 1935–1945. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Sakurai, Y .; Колокольцов А.А.; Chen, CC; Тидвелл, МВт; Баута, МЫ; Klugbauer, N .; Grimm, C .; Wahl-Schott, C .; Biel, M .; Дэйви, Р. А. Вирус Эбола. Двухпористые каналы контролируют проникновение вируса Эбола в клетки-хозяева и являются мишенями для лечения заболеваний. Наука 2015 , 347 , 995–998. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Dang, Z .; Юнг, К .; Zhu, L .; Lai, W .; Xie, H .; Ли, К. Х .; Huang, L .; Чен, CH Идентификация и синтез хинолизидинов с противогриппозной активностью вируса. ACS Med. Chem. Lett. 2014 , 5 , 942–946. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Дай, JP; Ван, QW; Вс, Ы .; Гу, LM; Дэн, HX; Чен, XX; Ли, WZ; Ли, К.С. Оксиматрин подавляет репликацию и воспаление вируса гриппа А через пути TLR4, p38 MAPK и NF-κB. Int. J. Mol. Sci. 2018 , 19 , 965. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Li, SY; Chen, C .; Чжан, штаб-квартира; Guo, HY; Wang, H .; Wang, L .; Чжан, X .; Hua, SN; Yu, J .; Сяо, PG; и другие. Идентификация природных соединений с противовирусной активностью против коронавируса, связанного с SARS. Антивирь. Res. 2005 , 67 , 18–23. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Kim, HY; Шин, HS; Парк, H .; Kim, YC; Yun, YG; Парк, С .; Шин, HJ; Ким, К. В пробирке ингибирование коронавируса репликаций от традиционно используемых лекарственных растительных экстрактов, Cimicifuga корневище , Мелии коры головного мозга , Coptidis корневищ и Phellodendron коры головного мозга . J. Clin. Virol. 2008 , 41 , 122–128. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Kim, DE; Мин, JS; Jang, MS; Ли, JY; Шин Ю.С. Песня, JH; Ким, HR; Kim, S .; Джин, YH; Квон, С. Природные бис-бензилизохинолиновые алкалоиды - тетрандрин, фанхинолин и цефарантин, подавляют заражение коронавирусом OC43 человеческих клеток легких MRC-5. Биомолекулы 2019 , 9 , 696. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Филдинг, Британская Колумбия; da Silva Maia Bezerra Filho, C .; Исмаил, Н .; Суза, Д.П. Алкалоиды: терапевтический потенциал против коронавирусов человека. Molecules 2020 , 25 , 5496. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Wu, R .; Wang, L .; Куо, HD; Shannar, A .; Peter, R .; Chou, PJ; Li, S .; Худликар, Р .; Лю, X .; Liu, Z .; и другие. Обновленная информация о текущих терапевтических препаратах для лечения COVID-19. Curr. Pharmacol. Rep. 2020 , 11 , 1–15. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] Della-Torre, E .; Делла-Торре, Ф .; Кусанович, М .; Scotti, R .; Рамирес, Джорджия; Dagna, L .; Тресольди, М. Лечение COVID-19 колхицином в условиях общественного здравоохранения. Clin. Иммунол. 2020 , 217 , 108490. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Тан, GT; Пеццуто, JM; Кингхорн, AD; Хьюз, SH Оценка натуральных продуктов как ингибиторов обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). J. Nat. Prod. 1991 , 54 , 143–154. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Kim, SY; Kim, H .; Kim, SW; Ли, штат Северная Каролина; Yi, CM; Heo, J .; Ким, Би Джей; Ким, штат Нью-Джерси; Inn, KS. Эффективный противовирусный подход к вирусу гепатита B с использованием NJK14047, нового и селективного ингибитора митоген-активируемой протеинкиназы бифениламида p38. Противомикробный. Агенты Chemother. 2017 , 61 , e00214 – e00217. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Рей, Ф.А.; Лок, С. М. Общие черты вирусов в оболочке и значение для дизайна иммуногена для вакцин следующего поколения. Cell 2018 , 172 , 1319–1334. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Vigant, F .; Сантос, Северная Каролина; Ли Б. Противовирусные препараты широкого спектра действия против слияния вирусов. Nat. Rev. Microbiol. 2015 , 13 , 426–437. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] Rout, J .; Свейн, Британская Колумбия; Трипати, У. Исследование in silico молекул пряностей как мощного ингибитора SARS-CoV-2. J. Biomol. Struct. Дин. 2020 , 1–15. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Младший, AG; Tolouei, S .; Дос Рейс Ливеро, ФА; Гаспаротто, Ф .; Boeing, T .; де Соуза, П. Природные агенты, модулирующие АПФ-2: обзор соединений с потенциалом против инфекций SARS-CoV-2. Curr. Pharm. Des. 2021 , 27 , 1588–1596. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] Lv, XQ; Zou, LL; Tan, JL; Li, H .; Ли, младший; Лю, штат Нью-Йорк; Донг, Б .; Песня, DQ; Пэн, З.Г. Алоперин подавляет проникновение вируса гепатита С в клетки, нарушая интернализацию от эндоцитоза до процесса слияния мембран. Евро. J. Pharmacol. 2020 , 883 , 173323. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] Энхтайван, Г .; Muthuraman, P .; Kim, DH; Мистри, Б. Открытие производных на основе берберина в качестве средства против гриппа путем блокирования нейраминидазы. Биоорг. Med. Chem. 2017 , 25 , 5185–5193. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Buzón, V .; Cladera, J. Влияние холестерина на взаимодействие гибридного пептида GP41 ВИЧ с модельными мембранами. Важность дипольного потенциала мембраны. Биохимия 2006 , 45 , 15768–15775. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Barz, B .; Вонг, ТС; Kosztin, I. Кривизна мембраны и площадь поверхности на липид влияют на конформацию и олигомерное состояние гибридного пептида ВИЧ-1: комбинированное исследование FTIR и MD моделирования. Биохим. Биофиз. Acta 2008 , 1778 , 945–953. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] Matsuda, K .; Hattori, S .; Komizu, Y .; Kariya, R .; Ueoka, R .; Okada, S. Cepharanthine подавлял передачу ВИЧ-1 из клетки в клетку и внеклеточную инфекцию посредством модификации текучести клеточной мембраны. Биоорг. Med. Chem. Lett. 2014 , 24 , 2115–2117. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Ашкенази, А .; Виард, М .; Унгер, Л .; Blumenthal, R .; Шай, Ю. Сфингопептиды: ингибиторы слияния на основе дигидросфингозина против ВИЧ-1 дикого типа и устойчивого к энфувиртиду. FASEB J. 2012 , 26 , 4628–4636. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] Pattnaik, GP; Чакраборти, Х. Коронин 1, производный триптофан-аспарагиновой кислоты, содержащий пептиды, ингибирует слияние мембран. Chem. Phys. Липиды 2018 , 217 , 35–42. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Сардар, А .; Лахири, А .; Kamble, M .; Маллик, AI; Тарафдар, П.К. Трансляция стратегии выживания микобактерий для разработки ингибитора слияния на основе липопептидов. Энгью. Chem. Int. Эд. Англ. 2021 , 60 , 6101–6106. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Морено, MR; Guillén, J .; Перес-Берна, AJ; Amorós, D .; Гомес, AI; Bernabeu, A .; Villalaín, J. Характеристика взаимодействия двух пептидов от N-конца домена NHR gp41 ВИЧ-1 с фосфолипидными мембранами. Биохимия 2007 , 46 , 10572–10584. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Franquelim, HG; Veiga, AS; Weissmüller, G .; Сантос, Северная Каролина; Кастаньо, М. А. Раскрытие молекулярных основ селективности сифувиртида, ингибитора слияния ВИЧ-1, в отношении жестких мембран, богатых фосфатидилхолином. Биохим. Биофиз. Acta 2010 , 1798 , 1234–1243. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Калводова, Л .; Сампайо, JL; Cordo, S .; Эйсинг, CS; Шевченко, А .; Саймонс, К. Липидомы вируса везикулярного стоматита, вируса лесного семлики и плазматическая мембрана хозяина проанализированы методом количественной масс-спектрометрии. J. Virol. 2009 , 83 , 7996–8003. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Merz, A .; Long, G .; Hiet, MS; Брюггер, В .; Chlanda, P .; Andre, P .; Виланд, Ф .; Krijnse-Locker, J .; Бартеншлагер, Р. Биохимические и морфологические свойства частиц вируса гепатита С и определение их липидома. J. Biol. Chem. 2011 , 286 , 3018–3032. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Герл, MJ; Сампайо, JL; Городской, С .; Калводова, Л .; Verbavatz, JM; Binnington, B .; Lindemann, D .; Лингвуд, Калифорния; Шевченко, А .; Schroeder, C .; и другие. Количественный анализ липидомов оболочки вируса гриппа и апикальной мембраны клеток MDCK. J. Cell Biol. 2012 , 196 , 213–221. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Чика, MC; Hui, E .; Liu, H .; Chapman, ER Synaptotagmin блокирует комплекс SNARE перед тем, как запустить быстрое и эффективное слияние мембран в ответ на Ca 2+ . Nat. Struct. Мол. Биол. 2008 , 15 , 827–835. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Lai, AL; Millet, JK; Daniel, S .; Фрид, JH; Whittaker, GR. Пептид слияния SARS-CoV образует расширенную платформу слияния, состоящую из двух частей, которая нарушает порядок мембран кальций-зависимым образом. J. Mol. Биол. 2017 , 429 , 3875–3892. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Ян, Q .; Guo, Y .; Li, L .; Хуэй, С.В. Влияние головной группы липидов и стресса упаковки на индуцированную полиэтиленгликолем агрегацию и слияние фосфолипидных пузырьков. Биофиз. J. 1997 , 73 , 277–282. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Lentz, BR PEG как инструмент для понимания слияния мембран. Евро. Биофиз. J. 2007 , 36 , 315–326. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Хелашвили, Г .; Plante, A .; Докторова, М .; Weinstein, H. Ca 2+ -зависимый механизм встраивания и дестабилизации мембраны пептидом слияния SARS-CoV-2. Биофиз. J. 2021 , 120 , 1105–1119. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Монталь, М .; Мюллер П. Формирование бимолекулярных мембран из липидных монослоев и изучение их электрических свойств. Proc. Nat. Акад. Sci. USA 1972 , 65 , 3561–3566. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Андерсен, О.С.; Финкельштейн, А .; Кац, I .; Касс, А. Влияние флоретина на проницаемость тонких липидных мембран. J. Gen. Physiol. 1976 , 67 , 749–771. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Folli, C .; Calderone, V .; Оттонелло, S .; Bolchi, A .; Zanotti, G .; Стоппини, М .; Берни, Р. Идентификация, связывание ретиноидов и рентгеновский анализ человеческого ретинол-связывающего белка. Proc. Natl. Акад. Sci. USA 2001 , 98 , 3710–3715. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] Мартин-Асебес, Массачусетс; Merino-Ramos, T .; Blázquez, AB; Casas, J .; Escribano-Romero, E .; Собрино, Ф .; Saiz, JC. Состав липидной оболочки вируса Западного Нила раскрывает роль метаболизма сфинголипидов в биогенезе флавивирусов. J. Virol. 2014 , 88 , 12041–12054. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Акимов С.А.; Молотковский, Р.Дж.; Кузьмин П.И.; Галимзянов, Т.Р .; Батищев, О.В. Континуумные модели синтеза мембран: Эволюция теории. Int. J. Mol. Sci. 2020 , 21 , 3875. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Ketter, E .; Рэндалл, Г. Влияние вируса на липиды и мембраны. Анну. Rew. Virol. 2019 , 6 , 319–340. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] де Лима, Вирджиния; Каро, MS; Манфорд, ML; Desbat, B .; Dufourc, E .; Pasa, AA; Кречинский-Паша, Т.Б. Влияние мелатонина на порядок мембран на основе фосфатидилхолина. J. Pineal Res. 2010 , 49 , 169–175. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] Торресильяс, А .; Schneider, M .; Фернандес-Мартинес, AM; Аусили, А .; де Годос, AM; Corbalán-García, S .; Gómez-Fernández, JC. Капсаицин разжижает мембрану и локализуется вблизи границы раздела липид-вода. ACS Chem. Neurosci. 2015 , 6 , 1741–1750. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] Lebecque, S .; Crowet, JM; Lins, L .; Делори, БМ; du Jardin, P .; Фоконье, ML; Делеу, М. Взаимодействие между аллелохимическими соединениями ячменя, грамина и горденина, и искусственными липидными бислоями, имитирующими плазматическую мембрану растений. Sci. Rep. 2018 , 8 , 9784. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Ashrafuzzaman, M. Amphiphiles, капсаицин и тритон X-100 регулируют адсорбцию на мембране химиотерапевтического препарата колхицина и эффективность образования ионных пор. Saudi J. Biol. Sci. 2021 , 28 , 3100–3109. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] Ashrafuzzaman, M .; Tseng, CY; Duszyk, M .; Тушинский, Ю.А. Химиотерапевтические препараты образуют ионные поры в мембранах из-за физического взаимодействия с липидами. Chem. Биол. Drug Des. 2012 , 80 , 992–1002. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ] Pentak, Д. В пробирке спектроскопического исследования Piperine-инкапсулированный наноразмерных липосом. Евро. Биофиз. J. 2016 , 45 , 175–186. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Зидовецкий, Р .; Шерман, И. В.; Атия, А .; Де Боек, Х. Исследование ядерно-магнитного резонанса взаимодействия противомалярийных препаратов хлорохина, хинакрина, хинина и мефлохина с бислоями дипальмитоилфосфатидилхолина. Мол. Biochem. Паразитол. 1989 , 35 , 199–207. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Swain, J .; Кумар Мишра, А. Местоположение, поведение разделения и взаимодействие капсаицина с липидной двухслойной мембраной: исследование с использованием его собственной флуоресценции. J. Phys. Chem. В 2015 , 119 , 12086–12093. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] Ефимова, СС; Захарова А.А.; Остроумова О.С. Алкалоиды модулируют функционирование ионных каналов, продуцируемых антимикробными средствами, через влияние на липидный хозяин. Передний. Cell Dev. Биол. 2020 , 8 , 537. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] Тейлор, KM; Моррис, Р.М. Термический анализ поведения фазовых переходов в липосомах. Термохим. Acta. 1995 , 248 , 289–301. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   McElhaney, RN Использование дифференциальной сканирующей калориметрии и дифференциального термического анализа в исследованиях модельных и биологических мембран. Chem. Phys. Липиды 1982 , 30 , 229–259. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Закария, МЮ; Fayad, E .; Althobaiti, F .; Zaki, I .; Абу Алмаати, AH. Статистическая оптимизация нанопузырьков с использованием солей желчных кислот в качестве потенциальной платформы для пероральной доставки пиперина: усиление противовирусной и противовоспалительной активности у мышей, зараженных БВРС-КоВ. Препарат Делив. 2021 , 28 , 1150–1165. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Hegeto, LA; Калеффи-Феррачоли, КР; Накамура-Васконселос, СС; Алмейда, Алабама; Балдин В.П .; Накамура, резюме; Сикейра, VLD; Скодро, РБЛ; Кардосо, Р.Ф. Комбинаторная активность пиперина и противотуберкулезных препаратов in vitro при Mycobacterium tuberculosis . Туберкулез (ред.) 2018 , 111 , 35–40. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Первичный qHTS для определения ингибиторов проникновения клеток SARS-CoV-2. (по состоянию на 14 июля 2021 г.).

    

   Мирян, М .; Багерния, М .; Sahebkar, A .; Сулеймани, Д .; Rouhani, MH; Iraj, B .; Аскари, Г. Влияние совместного приема куркумина и пиперина на клинические признаки, продолжительность, тяжесть и воспалительные факторы у пациентов с COVID-19: структурированное резюме протокола исследования для рандомизированного контролируемого исследования. Trials 2020 , 21 , 1027. [ Google Scholar ] [ CrossRef ]

    

   Аскари, G .; Alikiaii, B .; Сулеймани, Д .; Sahebkar, A .; Мирджалили, М .; Feizi, A .; Iraj, B .; Багерния, М. Влияние добавок куркумина и пипина на клинический статус, уровень смертности, окислительный стресс и воспалительные маркеры у тяжелобольных пациентов интенсивной терапии с COVID-19: структурированное резюме протокола исследования для рандомизированного контролируемого исследования. Испытания 2021 , 22 , 434. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Pawar, KS; Мастуд, РН; Павар, СК; Павар, СС; Bhoite, RR; Bhoite, RR; Кулькарни, М.В. Deshpande, AR Пероральный куркумин с пиперином в качестве адъювантной терапии для лечения COVID-19: рандомизированное клиническое испытание. Передний. Pharmacol. 2021 , 12 , 669362. [ Google Scholar ] [ CrossRef ] [ PubMed ]

    

   Примечание издателя : MDPI остается нейтральным в отношении юрисдикционных претензий на опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

    

    

   © 2021 Авторы. Лицензиат MDPI, Базель, Швейцария. Эта статья представляет собой статью в открытом доступе, распространяемую в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution (CC BY).

   Биомедицина, научное открытие лекарства от коронавируса в ПДФ формате

   Средство от коронавируса черноплодная рябина, гранат и зеленый чай

   Ученые из Института молекулярной вирусологии Медицинского центра Университета Ульма в результате своих исследований нашли несколько натуральных растительных продуктов, которые могут подавлять до 97% патогенов коронавирусной инфекции в организме человека. Результаты научного открытия экспертов опубликовали на портале bioRxiv. Специалисты напомнили, что любой респираторный вирус первым дело поражает глотку человека. Вирулицидным эффектом при таком заболевании обладают соки черноплодной рябины и граната, а также натуральный зеленый чай.

   

   Antiviral activity of plant juices and green tea against SARS-CoV-2 and influenza virus in vitro Carina Conzelmann, Tatjana Weil, Rüdiger Groß, Peggy Jungke, Bruno Frank, Maren Eggers, Janis A. Müller, Jan Münch doi: https://doi.org/10.1101/2020.10.30.360545 This article is a preprint and has not been certified by peer review [what does this mean?]. 000018310 AbstractFull TextInfo/HistoryMetrics Preview PDF

    

   Abstract Respiratory viruses initially infect the naso- and oropharyngeal regions, where they amplify, cause symptoms and may also be transmitted to new hosts. Preventing initial infection or reducing viral loads upon infection might soothe symptoms, prevent dissemination into the lower airways, or transmission to the next individual. We here analyzed the potential of plant derived products to inactivate SARS-CoV-2 and influenza virus. We found that black chokeberry (Aronia melanocarpa) juice, pomegranate (Punica granatum) juice, and green tea (Camellia sinensis) have virucidal activity against both viruses, suggesting that oral rinsing may reduce viral loads in the oral cavity thereby lowering virus transmission.

    

   Background Respiratory viruses such as influenza viruses and coronaviruses pose a significant threat to global health and are a substantial social, economic and healthcare burden, recently exemplified by the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) . For SARS-CoV-2, the long incubation period of up to 14 days, subclinical course and high transmissibility before onset of symptoms has led to unprecedented spread around the globe . Respiratory viruses initially infect the upper airways, both the naso- and oropharyngeal areas, where they amplify, cause respiratory symptoms  and spread to new hosts. Recent studies suggest gargling with commercial oral rinses may reduce virus spread and potentially infection . Several natural products also have direct antiviral activity or may ameliorate symptoms of respiratory infections. Pomegranate (Punica granatum)  and black chokeberry (Aronia melanocarpa)  extracts have been shown to be antivirally active against influenza viruses in vitro, elderberry syrup (Sambucus nigra) showed improved symptom relief in influenza patients , and a meta-analysis showed that gargling green tea (Camellia sinensis) lowered incidences of influenza infections . Natural products with a broad-spectrum antiviral activity would therefore be highly useful to reduce spread of respiratory viruses in the population, as they are inexpensive and rapidly deployable. Here, we evaluated the in vitro virucidal activity of green tea and herbal juices with prospective use as oral rinses against the enveloped respiratory viruses, SARS-CoV-2 and influenza A virus (IAV) and the naked adenovirus type 5 (AdV5). We found that influenza A virus is highly susceptible to inactivation by all tested substances. SARS-CoV-2 was less affected, however, inactivated by chokeberry juice and sensitive to green tea and pomegranate juice. AdV5 was resistant to most products, but viral titers were reduced by chokeberry juice. These findings underline the potential of common plant derived food products to contribute to the prevention of enveloped respiratory virus infections and diseases, where chokeberry juice was the most potent natural product tested herein.

    

   Methods Herbal substances Green tea (Bio-Grüntee Japan Sencha Tee-Gschwendner Nr. 700; pH 4.46) was prepared by infusing 3 g of leaves with 0.1 g ascorbic acid (Sigma Aldrich) for 4 min in 300 ml freshly boiled water under gentle movement, followed by filtration. Black chokeberry juice (Bio-Aronia Direktsaft Fa. Aronia original L2719; pH: 3.69), pomegranate juice (Satower Granatapfelsaft Direktsaft klar; pH: 2.99), and elderberry juice (Satower Fliederbeersaft; pH: 4.13) with valid best before date were kept refrigerated until use.

    

   Cell culture Vero E6 (Cercopithecus aethiops derived epithelial kidney) cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco) which was supplemented with 2.5% heat-inactivated fetal calf serum (FCS), 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, and 1x non-essential amino acids. Madin Darby canine kidney cells (MDCK) and A549 (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial) cells were grown in minimal essential medium with Earle’s salts (EMEM; Biochrom AG, Berlin, Germany) supplemented with 1% non-essential aminoacids (Biochrom AG, Berlin, Germany), 10% FCS. BHK-21 (Mesocricetus auratus kidney) cells were grown in DMEM (CCPro) with 10% FCS. For experiments, cells were seeded in medium containing 2% FCS. Cells were incubated at 37°C in a 5% CO2 humidified incubator.

    

   Virus test strains and cultivation Virus was propagated by inoculation of respective target cells and culturing until strong cytopathic effect was visible. The supernatant was then harvested, centrifuged to deplete cellular debris, aliquoted and stored at −80°C as virus stocks. Modified vaccinia virus Ankara (provided from the Institute of Animal Hygiene and Veterinary Public Health of the University Leipzig) was passaged on BHK-21 cells (provided by Friedrich Löffler institute), influenza A virus A/H1N1/Brisbane/59/2007 (Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & Co. KG) on MDCK cells (ATCC), adenovirus type 5, strain adenoid 75 (kindly provided by Prof. Sauerbrei, University of Jena, Jena, Germany) on A549 cells (ATCC) and SARS-CoV-2 BetaCoV/France/IDF0372/2020 (obtained through European Virus Archive global) on Vero E6 cells (ATCC).

    

   Infection assays To determine the virucidal activity of the herbal substances, they were mixed with the respective virus, incubated for a specified contact time at room temperature, and the remaining infectivity determined by tissue culture infectious dose 50 (TCID50) endpoint titration. This quantitative suspension test as described in EN 14476 [10] was performed for Modified vaccinia virus Ankara (MVA), influenza A virus (IAV) and adenovirus type 5 (AdV5) by incubating the respective virus with chokeberry, elderberry, or pomegranate juice, green tea, or buffer as control. Briefly, the efficacy of the tested products was examined as an 80% solution in the presence of 10% interfering substance (5% (w/v) BSA Fraction V (Sigma Aldrich), 0.4% (w/v) Mucin bovine Glandula submandibularis Type I-S (Sigma Aldrich), 5% (w/v) yeast extract (Sigma Aldrich)). SARS-CoV-2 was analyzed in 90% product. After the specified contact time, the test mixture was serially diluted 10-fold and titrated onto a 96 microtiter plate containing a confluent monolayer of the respective target cells in sextuplicates and the cells cultured until strong CPE was visible. IAV infected cells were additionally immunostained. Cells were then examined with a light microscope, the infected wells counted, and TCID50 calculated according to Spearman-Kaerber. If the cytotoxicity of the compound succeeded the lower limit of quantification (LLOQ), the titer was adjusted accordingly. The virucidal activity was determined by the difference of the logarithmic titer of the virus control minus the logarithmic titer of the virus incubated with the substance to test.

    

   Results To assess the virucidal potential of four plant-derived products, we performed a quantitative suspension test using MVA (EN 14476 ) which is a resilient surrogate virus that is used for the validation of virucidal disinfectants against all enveloped viruses according to the European Guidance on the Biocidal Products Regulation . While no reduction in viral titer was observed upon incubation with control buffer, 5-minute incubation with chokeberry juice, elderberry juice, pomegranate juice, or green tea yielded a 3.17, 0.67, 1.0 or 1.0 log10 decrease in infectivity, respectively (Figure 1, Table 1), indicating that the tested products are generally active against enveloped viruses. An incubation time of 20 minutes was only marginally more potent, suggesting a rapid acting antiviral effect. We then analyzed the two respiratory enveloped viruses responsible for the “swine flu” in 2009/2010 and the ongoing COVID-19 pandemic, IAV and SARS-CoV-2, respectively, as well as AdV5 as a naked control virus. A 5-minute incubation with chokeberry juice yielded most potent antiviral activities and inactivated IAV, SARS-CoV-2 and also AdV5 to 99.99%, 96.98%, and 93.23%, respectively (Figure 1, Table 1). IAV was most susceptible to all products and infectivity reduced >99% by elderberry juice, pomegranate juice and green tea. SARS-CoV-2 titers were reduced approximately 80% by pomegranate juice and green tea already after 1-minute incubation, however, unaffected by elderberry juice, corresponding to the results obtained with the more resistant surrogate MVA. The naked AdV5 was resistant to three out of four products, however, susceptible to chokeberry juice (Figure 1, Table 1). In summary, IAV is highly susceptible to all analyzed products, whereas SARS-CoV-2 can be efficiently inactivated by chokeberry juice and is to a lower level affected by pomegranate juice or green tea. 

    

   - Так, сок черноплодной рябины снижает активность коронавирусной инфекции на 97%, а гранат и зеленый чай способы подавить до 80% патогенов COVID-19, - говорится в статье.

    

   

    

    

   По мнению ученых, натуральные соки и зеленый чай могут значительно ослабить коронавирусной инфекцию, поскольку, попадая в организм человека, создают кислую среду и содержат оказывающие негативное воздействие на вирус растительные полифенолы.

    

   - Предотвращение первоначального инфицирования или снижение вирусной нагрузки на организм в случае заражения благодаря этим продуктом может облегчить симптомы заболевания, а также предотвратить распространение в нижние дыхательные пути или передачу другому человеку, - говорится в исследовании.

    

   В ходе исследования ученые установили, что сок черноплодной рябины может подавить до 97% вируса SARS-СoV-2. Еще активнее подавлялся вирус гриппа. Также эффективность показали зеленый чай и сок граната.

    

   Специалисты отметили, что респираторные вирусы инфицируют носоглотку и ротоглотку, где они усиливаются и вызывают симптомы. Предотвращение первоначального инфицирования могло бы предотвратить распространение вируса в нижние дыхательные пути или передачу другому человеку. В связи с этим был проанализирован потенциал продуктов растительного происхождения в борьбе с инфекциями гриппа и коронавируса.

    

   

    

   «Мы обнаружили, что сок черноплодной рябины (Aronia melanocarpa), сок граната (Punica granatum) и зеленый чай (Camellia sinensis) обладают вирулицидной активностью против обоих вирусов, что позволяет предположить, что полоскание ротовой полости может снизить вирусную нагрузку в полости рта, тем самым снижая передачу вируса», — говорится в работе ученых. Специалисты объяснили, что эти и другие натуральные соки, а также зеленый чай способны ослабить вирусы за счет кислой среды и растительных полифенолов 80%. Например, сироп бузины (Sambucus nigra) показал способность облегчать симптомы у больных гриппом.